利用离体牛角膜多次暴露方法评测化妆品套装的眼刺激性

从20世纪90年代开始，眼刺激的动物实验替代方法陆续进入验证程序。2009年，牛角膜浑浊度和渗透性(Bovine Corneal Opacity and Permeability，BCOP)试验被世界经济合作和发展组织(Organization for Economic Cooperation and Development，OECD)认可，列入化学品毒性测试指南的眼刺激替代方法(TG 437)。目前，有效的和法规认可的眼刺激替代方法共有8项[1]。2015年，OECD起草了用于眼刺激性的测试和评估的整合方法(Integrated Approach on Testing and Assessment，IATA)，并于2017年7月20日正式发布指南263[2]。IATA详细说明了BCOP等替代方法在眼刺激性评估中的应用，并提倡使用证据权重和整合策略的测试模式。因此，替代方法的优化和组合使用是化妆品安全评价的研究重点，例如利用BCOP标准方法具有的快速、简便、不受样品限制、参数可定量等优点，将其单独或组合用于化学品、个人护理品配方和成品、抗菌产品、家居护理品等的单次眼刺激性预测[3-6]。在标准方法上建立的BCOP改良方法，如增加测试参数、增加组织学评分和延长培养时间等可提高预测的准确性和用于刺激后恢复作用的研究[7，8]。而BCOP方法用于多重暴露的研究尚未见报道。本文基于标准的BCOP方法，在首次暴露后，增加二次或三次暴露，模拟使用过程中可能反复接触眼睛的情况，初步建立多次眼暴露模型，以获得多次暴露的体外方法测试数据，为开发更加舒缓的产品提供参考。

1 实验部分

1.1 主要材料、试剂与仪器

牛眼球，购自广州郊区屠宰场，新鲜离体牛眼球浸泡于冰冷HBSS内运回实验室。

含酚红的MEM培养基、无酚红的MEM培养基、HBSS缓冲溶液、荧光素钠，美国Sigma公司；胎牛血清，美国Gibco公司；无水乙醇、含Ca2+和Mg2+的DPBS，广州化学试剂厂。

角膜浊度仪，德国Basf公司；全波长酶标仪，美国Molecular Devices公司；恒温培养箱，重庆雅马拓科技有限公司；水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司；超纯水机，力康生物医疗科技控股有限公司。

化妆品套装，分别标记为A，B，C，D和E，每种套装含3～4个产品，市售。

1.2 实验方法

1.2.1 标准测试法

参考OECD指南[1]对每种套装中的产品分别单独进行测试。

1)分离和装配角膜：从新鲜牛眼球上完整切下角膜，周边保留2～3 mm巩膜，角膜装配在特制的分前后室的角膜支架中。前后室均填满无酚红的MEM培养基，于(32±1) ℃培养箱中平衡1 h，更换前后室培养基后用浊度仪读取角膜本底值(初始OP)。

2)加样暴露：移除前室培养基后加入750 μL受试样品，于培养箱中暴露10 min，充分清洗后，将前室重新填满新鲜的无酚红MEM培养基后返回培养箱进行后孵育2 h。

3)浊度和渗透性检测：孵育结束后，再次读取浊度值(末次OP)；去除前室培养基，加入1 mL 0.4%由含Ca2+和Mg2+的DPBS配制的荧光素钠溶液，孵育90 min。收集后室全部液体，混匀后取360 μL在490 nm波长下读取吸光度值(OD)。以超纯水为阴性对照。

1.2.2 多次暴露测试法

对每种套装中的产品依次进行测试：

1)角膜分离和装配方法同1.2.1。

2)加样暴露：移除前室培养基，根据套装中产品的使用顺序依次加样并暴露，每次加入750 μL，每次暴露后读取浊度值。例如产品1暴露10 min，清洗去除样品后读取浊度值；再加入产品2暴露10 min，清洗去除样品后再次读取浊度值；连续操作3～4次；最后一次加样暴露10 min，去除样品残留后读取浊度值，于培养箱中进行后孵育2 h。

3)浊度和渗透性检测方法同1.2.1。以超纯水为阴性对照，操作步骤相同。

1.2.3 结果统计

计算浊度变化值(ΔOP=初始OP-末次OP)、校正浊度变化值(OPCor.=ΔOP样品-ΔOP阴性对照)和校正吸光度值(ODCor.=OD样品-OD阴性对照)，并计算体外刺激评分(In Vitro Irritancy Score，IVIS)，公式为：IVIS=OPCor.+15×ODCor.。根据UN GHS，IVIS≤3(无分类)；IVIS≥55(1类)；3<IVIS<55(无法预测)。每个样品重复5次实验。数据以“”表示，不同组间比较采用SPSS 20进行ANOVA方差分析，P<0.05认为差异具有统计学意义，P<0.01认为具有显著差异。

2 结果与讨论

2.1 标准测试法结果分析

本研究选择市售的5种化妆品套装(标记为A，B，C，D和E)均为面部洗护套装，对套装中的每一种产品进行单独测试，并根据说明书的产品使用顺序多次加样和暴露，以更接近消费者使用过程中可能存在的多次接触眼睛的实际情况。

同一套装内不同产品的单独测试结果见表1(见下页)，根据OECD TG 437(2017)分类标准，所有产品的IVIS≤3(无分类)，表明单个产品在本试验中均预测为无眼刺激性。

2.2 多次暴露测试法结果分析

采用多次暴露法测试同一套装内的不同产品，结果见表2(见下页)，其中顺序使用后的浊度值明显增加，吸光度值也明显升高。根据OECD TG 437(2017)分类标准，所有产品获得IVIS均大于3，且小于55，提示可能具有刺激性。

2.3 多次暴露测试法的浊度值

相比单独暴露时，随着暴露的进行，浊度值出现了不同程度的增加或减少，结果见图1。由图1可以看出，套装A和C的浊度值增加明显，套装E浊度值减少比较明显。套装A中，在使用A1后使用A2和A3，与单独使用A2和A3比较，其浊度值增加明显，分别增加了6.64和5.04；套装C中C2和C3暴露后分别较单次暴露时，浊度值分别增加了3.10和5.66；套装E中则分别增加了5.88和1.81；而套装B和D中，浊度值较单独暴露增加不明显，增加范围在0.41～2.01。提示多次暴露中，首次暴露后受试物可能影响角膜的生理状态，导致后续暴露时浊度值增加。浊度值反映角膜基质情况，正常角膜应当是“透亮”的，如果浊度值增加，提示角膜基质可能发生水肿或蛋白变性等，导致角膜透光性减弱，出现“发白”。

表1 不同产品单独暴露结果

Tab.1 Results of single exposure of different products 

表2 不同套装组合暴露结果

Tab.2 Results of multi-exposure of different kits 

注：各指标与标准方法(每个产品单独暴露)结果比较，* P<0.05，** P<0.01，下同。

图1 不同套装的浊度值

Fig.1 Opacity of different kits

2.4 多次暴露测试法的吸光度值

相比单次暴露，多次暴露后角膜的渗透性出现较大增加，结果见图2。对于渗透性指标，吸光度值用于评价角膜上皮层的完整性[9]，5种套装多次暴露后，相比单独暴露，暴露后的吸光度值均明显增大，尤其是套装C，4次暴露后，吸光度值达到0.87，提示角膜上皮层可能已经受损，导致荧光素钠漏出增加。

图2 不同套装的吸光度值

Fig.2 OD value of different kits

2.5 不同暴露模式的阴性对照结果分析

阴性对照(超纯水)的结果见图3。由图3可以看出，单独暴露和组合暴露后，阴性对照的IVIS分别为0.94和1.27，表明单独暴露和组合暴露后，阴性对照结果为无刺激性，且处于可接受范围内，提示组合暴露的过程中多次暴露和冲洗未影响角膜本身。

图3 阴性对照组数据

Fig.3 Data of negative control

本研究还发现随暴露进行，角膜浊度值增加，但在套装A和E中观察到角膜浊度恢复的情况，在套装A中，较上一次测定，第三次暴露后角膜浊度值减少了1.17，在套装E中第三次暴露比上一次暴露浊度值减少了3.47。此种情况可能与受试物的性质或功效有关，具体有待进一步研究。

本研究所参考的BCOP法已经完成验证并被OECD认可作为化学品测试指南，2017年10月9日OECD发布了更新版的TG 437[9]，在最新版测试指南中，增加了该方法作为评估严重眼损伤和眼刺激的IATA方法的重要性[2]。国外有学者采用离体眼刺激方法，评估眼药水多次暴露后对兔角膜的影响，该方法采用光学相干层析技术分析角膜变化，实现角膜的实时测量[10]。而该法采用具有天然三维结构离体牛角膜，通过测量暴露后产生的角膜浑浊度和渗透性的变化，获得体外评分并进行眼刺激性的预测，尤其适用于不同剂型的受试物测试，附加组织学检查可以更好地区分眼刺激性的程度，具有快速、简便等优点。国内于2014年首次建立该方法[3]，除了用于化妆品眼刺激性测试之外，还扩大了使用范围，并建立了BCOP法和与其他体外方法的组合预测模型[11-13]。对于化妆品产品及原料，GB 7919-1987[14]提到可以增加重复眼暴露测试，以证明其安全性，但该方法为动物实验，不利于快速筛查。本方法采用基于离体牛角膜的方法，作为快速、高通量的非动物测试，可以满足研发过程眼安全性评价的要求。

3 结论

在本研究的组合暴露中，离体角膜顺序暴露于不同化妆品套装后，对角膜浊度和渗透性产生了不同程度的影响，初次暴露后的角膜再次进行暴露，可导致浊度值继续增加，且数值分布更加离散，角膜渗透性同时明显增加，最终获得IVIS均大于3，提示多次眼暴露可能引起眼刺激性。鉴于多次/重复眼暴露评价目前国内外尚无成熟的体外方法，也有学者提出在每次暴露后增加30 min的后暴露，然后再进行浊度值测定，其将后暴露对刺激后角膜的作用纳入考虑范围[1]，其与本方法的差异有待进一步比较。本研究建立了适用于多次/重复暴露的改良BCOP测试法，接近受试物暴露途径，初步证明了该法适用于化妆品多次/重复眼安全性的体外评价，可用于舒缓产品的评估。