摘要：目的 基于双波长还原检测法构建微型化血液中CO检测专用仪。方法 装置以发光二极管（LED）为光源，结合半透半反镜对LED光强进行校正，聚醚醚酮（PEEK）模块制作检测通路，辅以光电转换、数据处理、结果显示等组件。结果 整机重量仅为540 g，尺寸为14 cm× 12 cm × 6.3 cm；检测池体积小于10 μL，总样品消耗量小于400 μL，有效光程10 mm，检测时间小于5分钟。结论 可满足临床及刑侦对血液中CO含量现场快速检测的需求。
关键词：发光二极管；微型；CO检测；血液
引言
随着科学的发展，各应用领域对分析测试结果实时性的要求不断提高，现场快速分析已成为分析科学的发展趋势之一。现场分析势必要求分析仪器的微型化和便携化，研制结构紧凑，使用方便的微型现场分析系统具有重要的现实意义。
CO中毒作为一种常见的中毒形式，不仅需要根据临床症状和体征进行快速诊断，患者/死者血液中的碳氧血红蛋白含量（HbCO%）更是判定CO中毒及程度的重要依据。在临床和刑侦中，血液为一氧化碳中毒重要检材，实现快速、高灵敏HbCO%检测对于挽救生命及案件的侦破皆具有重大意义。应用于血液中CO检测的方法包括：顶空气相色谱法[1]、血氧定量计法[2]、毛细管电泳法[3]、氧电极法[4]、傅立叶变换红外光谱法[5]、分光光度法等[6,7]。其中分光光度法具有样品前处理简单，检测速度快等优势。张婷等[7]对7种一氧化碳中毒血样分光光度含量测定方法进行了系统比较。其中还原法利用420 nm波长处碳氧血红蛋白呈现吸收峰，血红蛋白吸收较弱,在432 nm波长处血红蛋白呈现吸收峰，碳氧血红蛋白吸收较弱特点，根据比耳定律和吸光度加和原理，联立方程组获得血液中CO含量。传统分光光度计体积较大，不适合现场快速、实时检测。目前，市场上有多种微型分光光度计，如美国哈希便携式分光光度计[8]，便携式PORS-15V型快速光谱仪[9]，T3WS便携式水质快速检测仪[10]等，但并无针对血液中CO检测的专用微型仪器问世。
本文以发光二极管（LED）为光源，结合半透半反镜对光强进行校正，利用碳氧血红蛋白和血红蛋白在420 nm和430 nm不同吸收，基于还原法构建了微型化的血中CO含量检测专用仪，可以满足临床及刑侦对急性CO中毒快速诊断的需要。
1 实验材料和方法
1.1 试剂及仪器
连二亚硫酸钠，分析纯；CO中毒血样，新疆兵团公安局刑侦总队技术处提供；超纯水，Merck Millipore超纯水设备自制。
紫外可见分光光度计参比溶液：0.25%连二亚硫酸钠溶液。微型化血液中CO检测专用仪校准液：甲醇。测试血样：原血用0.25%连二亚硫酸钠溶液稀释2500倍。
紫外可见分光光度计（Thermo Scientific Evolution 220），设置扫描范围400-500 nm。
1.2 微型CO含量检测专用仪配件及使用方法
光源采用L420R-06 LED灯，结合420 nm，432 nm两个波长的窄带滤光片提供光度计所需光源。采用半透半反镜（10 mm×15 mm）将直射入检测池的入射光分光，分别射入参比池和检测池。滤光片模块为活动组件，通过一个金属推杆将相应滤光片推入光路获得相应波长的入射光。
检测池与参比池整合入PEEK模块，检测池尺寸：1.1 mm ID ×10 mm,有效光程约为10 mm ，其检测池体积约为9.2 μL。参比池尺寸：15 mm×9 mm×23.5mm。样品入口管为转接管，两段管路尺寸分别为0.5 mm ID×60 mm和2 mm ID ×100 mm，出口管尺寸为0.5 mm ID × 320 mm，总样品消耗体积约为400 μL。
使用方法：
1）开机预热1 min；
2）注射器取1mL甲醇注入加样口，待读数稳定后调节金属推杆分别在420 nm和432 nm测量，按校正键校正仪器参比值；
3）测量完成后用注射器吹出校准溶液，将稀释2500倍并放置反应2 min的血样注入加样口，待读数稳定后，分别按测量键在两个波长下进行测量；
4）测量完成后，点击“结果计算”键，直接得到HbCO% 浓度。
1.3 数据计算
紫外可见分光光度计测得420 nm、432 nm波长下吸光度值后代入以下公式计算碳氧血红蛋白含量。
[HbCO]%=（1.317 A420-0.988 A432）/ （0.844 A420+0.982 A432）×100% (1)
由于微型检测器采用滤光片获得所需波长入射光，其波长范围宽于紫外分光光度计入射光波长范围，致使对应的摩尔吸光系数产生偏差。为了校正入射光单色性差带来的误差，碳氧血红蛋白饱和度计算公式修正为：
[HbCO]%=[（1.317 A420-0.988 A432）×1.598/ （0.844 A420+0.982 A432）+0.019]×100% (2)
2 结果与讨论
2.1 仪器构建
针对分光光度法检测血液中CO检测方法（还原法）的特点，设计的微型化血中CO含量检测专用仪结构如图1所示，图2a也给出了实物图，图2 b为调节滤光片位置推杆。
图1 微型化血中CO含量检测专用仪光路图
图2 微型化血中CO含量检测专用仪实物图
微型化血中CO含量检测专用仪主要由LED光源、检测池、参比池、光电转换组件、信号放大及数据处理组件、控制组件、电源等组成。LED灯具有工作电压很低，工作电流很小，抗冲击和抗震性能好，可靠性高，寿命长的优点，且价格便宜。因此我们选用L420R-06 LED灯作为光源，其波长范围涵盖了测定所需两个波长，仅需一个LED灯即可。但是，LED也有光强不稳定的缺点，给分光光度法测量带来较大误差。我们在光路系统中引入内置参比池，采用半透半反镜分光，通过参比池光强对测量池光强进行实时校正，可完全消除LED本身光强变化带来的误差。由于LED在不同的空间角度光强相差较大，光路系统中光源发射的光直射入光路系统，也最大程度避免了光强变化。由于需要在420 nm和432 nm两个波长下采集数据，采用模块化光路系统，唯一活动部件为滤光片模块，而滤光片直径大于光入口直径，无需特殊准直组件即可保证入射光光强稳定。光路模块采用PEEK材料，此材料具有良好的生物兼容性，可以有效避免血液中的组分在检测通道表面的不可逆吸附，因此非常便于清洗。此外，这种材料不透光，可以避免环境中杂光对检测的干扰。
通过编制控制程序，将数据采集、信号处理和运算、过程控制和结果显示等一系列过程直接嵌入，实现自动化处理。过程控制和结果显示采用触摸屏，数据处理模块中嵌入了结果计算的程序。整机重量仅为540 g，尺寸为14 cm × 12 cm × 6.3 cm；检测池体积小于10 μL，总样品消耗量小于400 μL。整个操作简单、快速，保证其可便捷地应用于现场快速检测，使用人员无需特殊培训。
2.2 仪器和实验方法优化
双波长还原法测定血中CO含量采用0.25%连二亚硫酸钠溶液作为参比溶液，但是连二亚硫酸钠在空气中易氧化分解，而样品溶液配制过程中不可避免的会与空气接触，随着时间的增加，溶液会逐渐浑浊，致使透射光强减弱，造成较大误差，需要在参比溶液和样品配制好后尽快完成测定。因此我们选取了甲醇、水及0.25%连二亚硫酸钠溶液作为参比溶液进行对照试验，检测池透射光光强数据见表1。
从测定结果可以看出，选择甲醇、水及0.25%连二亚硫酸钠溶液作为参比溶液，其所测数据基本相当，无显著性差异，即选择这三种溶剂任何一种对样品的测定无影响。而甲醇相比水而言，可同时作为清洗光路的溶剂，因此我们在实验中选择用甲醇作为参比溶液。
在还原法中，建议血样稀释倍数为1000-2000倍。以稀释1000倍，2000倍，2500倍血样为样品，分别采用微型检测器和常规紫外-可见分光光度计进行了测定，测定结果见表2。
从测定结果可以看出，当样品被稀释至1000倍时，样品浓度较高，吸光度值大于1.0，测定误差较大。相对于大型紫外分光光度计而言，微型检测器测定值明显偏高。而稀释至2500倍时，吸光度值在0.15-1.0范围内，微型检测器测定据也与常规紫外分光光度计测定结果吻合。因此对于微型检测器，其最佳稀释倍数约为2500倍。
2.3 微型血液中CO含量检测专用仪性能评价
为了测试微型血液中CO含量检测专用仪的测量准确度，选取碳氧血红蛋白含量在20-70%区间样品在商品化紫外-可见分光光度计上同时进行对比试验，并对结果加以分析，结果见表3。
由表3可以看出，微型分光光度计测定结果与常规紫外分光光度计测定结果一致，测定绝对偏差绝对值在0%-2.8%之间，相对偏差绝对值在0%-5.1%之间，可以满足分析要求。
为了对微型血液中CO含量检测专用仪测定重复性加以评价，分别取HbCO%含量66.5%和49.3%的血样连续3次测定，结果见表4。微型检测器对样品进行多次平行测定时，与常规紫外分光光度计相比，其相对标准偏差略高，但均小于5%。
3 结论
综上所述，微型化血中CO含量检测专用仪体积小，使用方便，测定结果准确，满足临床及刑侦对血液中CO含量现场快速检测的需求。
