氨基化改性生物玻璃/明胶/胶原复合支架的研究*

0 引 言

组织工程主要利用种子细胞在多孔生物的三维支架上构建三维组织结构[1]。骨组织工程是一种新型骨缺损修复技术，通常骨支架材料[2]主要来自于自体骨、异体骨或人工骨替代材料。自体骨来源有限，异体骨受限于排异反应都无法大范围应用，因此人工骨替代材料的研究成为热点。骨组织工程替代材料由生长因子、种子细胞和支架3部分组成，支架作为生长因子和种子细胞的载体，必须具备优良的生物相容性、降解性、孔性能等。支架的主要功能是提供一个细胞粘附、增殖、生长和分化的平台，当支架降解时，能够促进骨细胞形成健康的新骨[3]。理想仿生支架的结构和组成都要与人体骨一致。骨由有机质和无机质组成，其中有机质由骨胶原纤维束和黏多糖蛋白组成，无机质则主要由碱性磷酸钙组成。

目前，骨支架替代材料已从单组份的无机陶瓷材料变成有机-无机复合材料，从单一的组分仿生，过渡到多组分、多级结构的功能仿生[4]。Masoud Mozafari等[5]使用冷冻干燥法制备的复合支架孔隙率72%～86%，矿化实验表明其明胶/生物玻璃复合支架可形成羟基磷灰石。

临床上，生物玻璃(BG)可促进骨修复和快速愈合，但纯生物玻璃受限于其高脆性和低断裂强度，使其不能广泛应用[6]。为克服这些缺点，将生物玻璃和其它物质共混是一种简单、有效的方法。采用可生物降解的聚合物和生物玻璃制备的复合支架可满足支架在生物活性、生物降解性、机械性能和结构等方面的要求[7]。

明胶(GEL)由胶原蛋白水解得到[8-9]，是一种变性的天然生物聚合物。明胶用于复合支架，具有低免疫性和无毒性，可填充于胶原和生物玻璃的孔隙，提高支架的稳定性。Ⅰ型胶原蛋白(COL)具有三股螺旋结构，有良好的生物相容性，是骨有机组分的主要部分，被大量应用于骨复合支架中。

本文采用酸-酶结合法提取Ⅰ型胶原蛋白，使用溶胶-凝胶法制备45S5型生物活性玻璃[10-11]；研究与分析了BG/GEL/COL复合支架的力学性能和降解性能，及其在模拟体液(SBF)中的矿化作用。在此基础上，对45S5型生物活性玻璃进行氨基化改性，制得了BG-NH2/GEL/COL复合支架，并分析了其抗压强度和降解性能。

1 实 验

1.1 实验原料

3-氨丙基三乙氧基硅烷(上海阿拉丁(Aladdin)试剂有限公司)、水溶性盐酸碳二亚胺(生化试剂，上海阿拉丁(Aladdin)试剂有限公司)、N-羟基琥珀酰亚胺(生化试剂，上海阿拉丁(Aladdin)试剂有限公司)、NaCl(分析纯)、NaHCO3(分析纯)、K2HPO4·3H2O(分析纯)、无水CaCl2(分析纯)、Na2SO4(分析纯)、三羟基氨基甲烷(分析纯)。

1.2 45S5型生物活性玻璃及其改性

按照参考文献[10-11]的方法制备45S5型生物活性玻璃(BG)，其平均粒径18 μm。在甲苯中，加入一定量的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，80 ℃下回流6 h改性。将改性后的生物活性玻璃粉体，用甲苯清洗3～5次[12]，于80 ℃下真空干燥24 h，得到氨基化改性后的生物活性玻璃(BG-NH2)。图1为生物活性玻璃表面氨基化改性机理示意图。

图1 生物活性玻璃表面氨基化改性机理示意图

Fig 1 Amino-modification mechanism of bioactive glass

1.3 BG/GEL/COL复合支架的制备

按照生物玻璃、明胶和Ⅰ型胶原蛋白的比例(表1)，制备出5种试样，加入水溶性盐酸碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，倒入模具中，于4 ℃交联24 h，放入冰箱冷冻，经冷冻干燥(GT2-Tyce-8，LYOTECH，Germany)后，得到复合支架。

表1 BG/GEL/COL复合支架的原料质量比

Table 1 The mass ratios for BG/GEL/COL composite scaffold

将氨基化改性后的生物玻璃作为无机组分，有机组分不变(n(无机)∶n(有机)=60∶40)，制备出如表2中的6种试样，加入水溶性盐酸碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)后，倒入模具中，于4 ℃交联24 h，预冻后经冷冻干燥(GT2-Tyce-8，LYOTECH，Germany)处理，得到复合支架。

表2 BG-NH2/GEL/COL复合支架中的原料质量比

Table 2 The mass ratios for BG-NH2/GEL/COL composite scaffolds

1.4 试样表征

1.4.1 红外光谱

取冷冻干燥后的复合支架，以KBr压片法制备试样，于傅立叶红外光谱仪(VERTEX，Bruker，Germany)上表征，扫描区间400～4 000 cm-1，分辨率4 cm-1，扫描次数16。

1.4.2 力学性能

参考Yunoki等[13]以1.2 mm/min的压缩速度纵向压缩待测试样，使其向下位移高度为总高度的50%后停止压缩，记录实验数据。

1.4.3 扫描电镜

将试样用导电胶固定于试样台上，表面喷金处理。采用JSM-7001F型场发射扫描电子显微镜观察BG/GEL/COL复合支架的表面形貌和结构，加速电压为3 kV。

1.4.4 体外降解

将试样在37 ℃下浸泡于盛有磷酸盐缓冲液(PBS，pH值=7.25)的容器中，材料质量和模拟体液体积比3 mg/2 mL，分别浸泡1，3，5，8，14，28 d后取出，用去离子水反复清洗3次，真空干燥后，称量所剩质量，Residue Weight是残余百分比，m1是降解前支架的质量，m2是降解后支架的质量

图2 胶原与氨基化改性生物活性玻璃间酰胺键形成示意图

Fig 2 The formation of amide bond between collagen and BG-NH2

1.4.5 体外降解后试样的结构分析

模拟体液[14-15](SBF)中含有NaCl、NaHCO3、K2HPO4·3H2O、无水CaCl2、Na2SO4、三羟基氨基甲烷、去离子水等。将试样在37 ℃下浸泡于盛有模拟体液的容器中，材料质量和模拟体液体积比3 mg/2 mL，分别浸泡1，3，5，10，15 d后取出，用丙酮和去离子水反复清洗3次后，再冷冻干燥得到待测试样，进行X射线衍射分析及扫描电镜观察。

2 结果与讨论

2.1 45S5型生物活性玻璃的粒径

由图3可知，生物活性玻璃在改性后的粒径也在18 μm左右，表明氨基化改性对生物活性玻璃的粒径并没有影响。

图3 生物活性玻璃氨基化改性后的粒径分布

Fig 3 Particle size distribution of amino-modified bioactive glass

改性前后生物活性玻璃的ζ电位见表3。改性前生物活性玻璃表面带负电，氨基化改性后表面显正电，且随着APTES用量的增多，其ζ电位值也逐渐变大，说明生物活性玻璃表面氨基数量也随之增多，但在APTES用量超过3%后，ζ电位值随APTES用量增多而减少。

2.2 BG/GEL/COL复合支架的抗压强度

图4是BG/GEL/COL复合支架的抗压强度。试样4的抗压强度最大，为5.97 MPa，在松质骨抗压强度的范围内(表4)[16]；随着BG含量的增多，其力学性能显著提高，由试样1的2.76 MPa提升为试样4的5.97 MPa。随着生物活性玻璃的加入，影响到胶原和明胶的聚集形态，增强了分子间的相互作用，使构成支架网络结构的纤维直径增大。试样5中BG含量达70%，其抗压强度却有所降低，可能是过量的BG破坏了其结构和聚集状态。

表3 不同浓度APTES改性后生物活性玻璃的ζ电位

Table 3 Zeta potential of bioactive glass after modified with different concentrations of APTES

图4 BG/GEL/COL复合支架的抗压强度

Fig 4 Compressive strength of BG/GEL/COL composite scaffolds

表4 骨的基本力学性能[16]

Table 4 The basic mechanical properties of bone

图5是不同APTES用量BG-NH2/GEL/COL复合支架的抗压强度。生物玻璃经过氨基化改性后，所制备的复合支架的抗压强度略有增加(6.15 MPa)。

图5 不同APTES用量BG-NH2/GEL/COL复合支架的抗压强度

Fig 5 Compressive strength of BG-NH2/GEL/COL composite scaffolds with different APTES amount

2.3 BG/GEL/COL复合支架的降解性能

图6是BG/GEL/COL复合支架的降解性能。由图6可知,(1) 降解实验的前3 d，试样质量没有明显变化，说明试样在此阶段只发生了微弱降解，该阶段主要是吸水溶胀；降解实验3 d后，试样开始迅速降解，至28 d试样降解反应趋于平衡；(2) 随着生物玻璃含量的增加，其降解速率逐渐减慢，28 d时的降解程度逐渐减少，说明可通过控制生物玻璃的含量来调节复合支架的降解速率和降解程度，制备满足体内降解速率要求的复合支架。

图6 BG/GEL/COL复合支架的降解性能

Fig 6 Degradation of different BG/GEL/COL composite scaffolds

胶原由不同氨基酸以肽键连接而成，在水溶液中会发生降解，胶原肽链的端基和侧链均含有氨基和羧基，即存在许多碱性基团和酸性基团，在溶液中结合碱或酸后，胶原分子间及肽链间的离子交联键和氢键将被打开，胶原吸水发生膨胀，随着降解时间的延长，各种交联键和次级键逐渐被破坏。

在胶原溶液中，一定pH值下，胶原分子间有一定的范德华力、氢键等相互作用，稳定存在。当加入生物活性玻璃后，生物活性玻璃在溶液中会释放出Ca2+，使溶液pH值升高，破坏胶原分子之间原有的平衡，使分子与分子间的斥力减小，引力增加，增强了胶原的聚集状态。同时，Ca2+也可与胶原分子上的羧基产生一定的静电作用，进一步强化其聚集状态，从而得到由粗化的胶原构成的复合支架，这样粗化的胶原不仅可提高其力学强度，也可显著提高支架的抗降解能力。

其中，无机和有机比例为70∶30和60∶40时支架的降解速率低于其它比例支架的降解速率。

由图7可知，BG-NH2/GEL/COL复合支架的降解速率与BG/GEL/COL复合支架的降解速率相比相对减缓，且在28 d时质量剩余32.96%，剩余质量提高了约7%～8%，表明氨基化改性提高了复合支架的稳定性，可能是部分生物玻璃表面的氨基与胶原分子或明胶分子上的羧基形成酰胺键，提高了BG-NH2/GEL/COL复合支架的稳定性。

图7 改性后BG-NH2/GEL/COL复合支架的降解性能

Fig 7 Degradation of different BG-NH2/GEL/COL composite scaffolds

2.4 复合支架的细胞毒性

MTT结果如表5,6和图8所示。表5和6分别是BG/GEL/COL和BG-NH2/GEL/COL复合支架浸提液培养细胞2，4，7 d后的光密度值和相对增殖度(570 nm)，图8是BG/GEL/COL和BG-NH2/GEL/COL复合支架浸提液培养细胞2，4，7 d后的细胞相对增殖度。

材料浸提液培养细胞在2，4，7 d后，成纤维细胞的相对增殖度均大于75%，说明BG/GEL/COL和BG-NH2/GEL/COL复合支架的细胞毒性等级为0级或1级，即无细胞毒性。从图8可知，随培养时间的延长，细胞相对增殖度增大，表明BG/GEL/COL复合支架有利于细胞的增殖，促进细胞生长；氨基化改性对细胞相对增殖度影响不大，也有利于细胞的增殖，且能促进细胞生长。MTT实验结果表明，BG/GEL/COL和BG-NH2/GEL/COL复合支架，具有较好的生物相容性。

表5 BG/GEL/COL复合支架的光密度和相对增殖度

Table 5 Optical density and relative multiplicity of composite scaffolds of BG/GEL/COL

表6 BG-NH2/GEL/COL复合支架的光密度值和相对增殖度

Table 6 Optical density and relative multiplicity of BG-NH2/GEL/COL composite scaffolds

图8 BG/GEL/COL复合支架和BG-NH2/GEL/COL复合支架的相对增殖度

Fig 8 The relative growth rate of composite scaffolds of BG/GEL/COL and BG-NH2/GEL/COL

2.5 BG/GEL/COL复合支架的傅立叶红外光谱

由图9可知，1 650 cm-1处峰是酰胺Ⅰ带羧基(CO)伸缩振动的特征吸收峰，该峰对胶原三级结构变化非常敏感，该峰的存在说明BG/GEL/COL复合支架中Ⅰ型胶原蛋白仍保持三股螺旋结构[17]。

图9 红外光谱图

Fig 9 FT-IR spectra

1 540 cm-1处峰是酰胺Ⅱ带的特征吸收峰，由N—H弯曲振动和C—H伸缩振动引起。1 240 cm-1处峰是C—N或N—H的伸缩振动吸收峰。1 030 cm-1处峰是C—N—C振动或C—O伸缩振动的吸收峰[18-20]。

850 cm-1处峰是Si—C伸缩振动峰，Si—OH与胶原中的—CN—发生化学键合作用，钙离子与游离的羧基螯合，导致酰胺谱带振动减弱，胶原的酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ带均减弱，且酰胺Ⅲ带(1 240 cm-1)明显消失。

图10是不同矿化时间后BG/GEL/COL复合支架在的红外光谱图。1 650和1 540 cm-1处峰是胶原酰胺Ⅰ、Ⅱ的特征峰，表明矿化前后胶原蛋白仍保持三股螺旋结构；560 cm-1是PO的伸缩振动峰，随矿化时间的延长，峰明显增强，可能是羟基磷灰石的生成。

图10 不同矿化时间后BG/GEL/COL复合支架的傅立叶红外光谱图

Fig 10 FT-IR spectra of BG/GEL/COL composite scaffold mineralized for different times

2.6 BG/GEL/COL复合支架的X射线衍射

图11是BG/GEL/COL复合支架矿化0，5，15 d后的XRD图。23°附近存在非晶态弥散峰，在26°(002)，32°(211)，39°(310)，46°(222)，49°(321)晶面出现衍射峰，通过比对标准JCPDS卡片[21](卡号72-1243)，发现这些峰对应的是磷灰石晶体的衍射峰。表明BG/GEL/COL复合支架在矿化15 d后表面有磷灰石生成[22]。

图11 不同矿化时间后BG/GEL/COL复合支架的XRD图

Fig 11 XRD images of BG/GEL/COL composite scaffold mineralized for different times

2.7 BG/GEL/COL复合支架的表面形貌

图12 不同矿化时间后BG/GEL/COL复合支架的SEM图。经过一段时间矿化后，在BG/GEL/COL复合支架表面形成磷灰石颗粒，随着矿化时间的延长，复合支架表面的磷灰石沉积颗粒增多，说明可在模拟体液中矿化得到磷灰石，为骨提供无机组分。

图12 不同矿化时间后BG/GEL/COL复合支架的SEM图

Fig 12 SEM images of BG/GEL/COL composite scaffold mineralized for different times

3 结 论

采用冷冻干燥技术，将生物活性玻璃、明胶和Ⅰ型胶原蛋白复合，制备了人工骨替代材料：

(1) 制备过程中，复合支架中生物玻璃和胶原、明胶间产生了氢键和化学键合作用，提高了骨复合支架的热稳定性；

(2) 生物活性玻璃/明胶/胶原复合支架能够在体液环境下矿化，形成羟基磷灰石；

(3) 对45S5型生物活性玻璃进行氨基化改性，可改善有机相和无机相相界面的相容性，提高复合支架的稳定性。