摘 要 电化学检测一般需加入电解质以降低溶液电阻，为解决天然药在层析纯化检测中无支持电解质的问题，研制了一种以液体石蜡－石墨为工作电极的电化学在线检测器，利用了Nafion N－324膜固体酸的性质，在不额外添加电解质的情况下，直接获得了杨梅素80%乙醇溶液（V／V）的循环伏安图。在恒电位0.53V下，实现了对层析液中有效物质的电化学在线检测。在2×10-5～1×10-2 mol／L范围内，峰面积（A）与杨梅素浓度（C）存在线性关系，线性方程为A＝2.7227C＋0.4341，r＝0.9976。在恒电位0.62V无支持电解质的80%乙醇溶液中，对30%竹叶黄酮粗提品纯化过程的在线检测，获得了时间－电流信号的流出曲线，可用于实际样品分析。
关键词 天然药物；Nafion膜；竹叶黄酮；循环伏安法；微流动池；碳糊电极
1 引 言
天然药有效成分的分离纯化具有重要的现实意义，目前，普遍采用的光谱技术对层析液进行在线监测；而电化学检测有着灵敏度高、设备简单等优势，亦可解决光谱对不敏感物质无法检测等问题。
黄酮类化合物属常见天然药物的有效成分［1］，具有较强的清除自由基的作用［2，3］，其自由基还原电位越低，抗氧化活性越强［4，5］，电活性也越强，适合于电化学检测。竹叶黄酮是从竹叶中提取出的含有黄酮类物质的泛称，其粗提品成分复杂，需经大孔吸附树脂提纯。碳糊电极对黄酮类化合物具有灵敏的响应［6～9］，可用于分析测定。但传统的电化学伏安检测需大量支持电解质，不符合在线监测的要求；因而需研究在较少或无支持电解质情况下的电化学检测新方法。
Nafion是一种由四氟乙烯与全氟－2－（磺酸乙氧基）丙基乙烯基醚的共聚物，有多种型号。基本都是以聚四氟乙烯为骨架，侧链一端为 --S O3-M＋，M＋通常为质子或碱金属离子，其特点是酸性中心单一，酸性强。在水、有机溶剂等液体中能表现出表面酸性质［10］。利用其固态酸性质，研究者设计了流动池，以沉积在Nafion膜上的贵金属为工作电极，在不添加支持电解质的情况下，测定了对苯二酚、4－丁基二茂铁、半胱氨酸等有机物的含量［11～13］。
本研究采用碳糊为工作电极，利用Nafion膜固体酸的性质，设计了一种新型流通式电化学在线检测器，可以在无支持电解质的情况下直接测定黄酮类化合物，且响应灵敏，装置结构简单，测定可靠，为天然药有效成分层析纯化过程的在线检测提供了一种低成本的替代手段。
2 实验部分
2.1 仪器、材料与试剂
CHI660B电化学工作站（上海辰华仪器有限公司）；VC9808＋3 1／2位数字万用表（深圳市胜利高电子科技有限公司）；KQ－100DB超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；PHSJ－4A型pH计和DDS－307电导率仪（上海雷磁仪器厂）；HL－2蠕动式恒流泵（上海青浦沪西仪器厂）。
参比电极AgCl／Ag丝、对电极铂丝（常熟贵金属有限公司）。Nafion N－324阳离子交换膜（美国杜邦公司）；H103大孔吸附树脂；石墨粉（国药集团化学试剂有限公司）；杨梅素（纯度98%，宁波德康生物制品有限公司）；竹叶黄酮粗提品（纯度30%，浙江安吉圣氏科技有限公司）。试剂均为分析纯，水为经氮气除氧的超纯水。
2.2 实验方法
图1 电化学检测器原理示意图
Fig.1 Schematic view of cell assembly
自制检测池（如图1所示），由A和B两块PVC板（约5.0cm ×5.0cm）加工而成。W为碳糊工作电极，R为参比电极，C为对电极。R与C在一孔室中并充有支持电解质，辅助参比室与W之间由Nafion阳离子膜（在pH＝2的H2SO4溶液中浸泡8h以上，使用前用超纯水冲洗）隔开，组成三电极流通测量体系。
石墨粉与液体石蜡按1g／mL的比例混匀，并保持可塑性。将碳糊填入工作电极孔中，压实并使铜引线充分接触碳糊，再用滤纸压磨电极表面，直至有金属光泽。将新制电极在无水乙醇中超声1min，再用超纯水反复清洗。用螺丝将测量装置组装一体，辅助参比室注入1.0mmol／L HCl底液，再在-0.2～1.0V电位内连续循环伏安（Cyclic voltammetry，CV）扫描，直至曲线稳定平整。每次使用后，用无水乙醇、超纯水依次冲洗。使用一星期后，重新填充碳糊电极并处理。
测试液从In端进入体系，从Out端流出，流经碳糊工作电极。可通过硅胶垫的厚薄调整工作电极与Nafion膜之间的距离。在流动相静止时，对不同浓度的杨梅素层析液进行CV扫描，电位窗口为-0.2～1.2V，扫速为100mV／s。在线流动测量时，其电位定在0.53V，采样间隔0.1s，测得时间－电流曲线。所有电化学测试均在室温下进行。
3 结果与讨论
3.1 液体石蜡与石墨粉配比
在碳糊电极中，液体石蜡起到粘合作用并不参与导电，应尽量少用。但由于液体石蜡的存在，许多有机物不仅可以被吸附在电极表面，而且可能会被液体石蜡萃取到电极表面内部，具有类似富集效应。因此需通过调整两者的比例，来确定最佳配比。
称取石墨粉1.0g，分别加入0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4和1.6mL液体石蜡，搅拌均匀，取适量制成工作电极。在2×10-5 mol／L杨梅素溶液（pH 2.0）中进行CV扫描，扫速100mV／s。取0.43V处的氧化峰电流与液体石蜡体积作关系图，同时测量电极两端的电阻值，结果如图2所示。
实验表明，随着液体石蜡的使用量增加，碳糊电极的响应逐渐增强，萃取作用为主要作用。当液体石蜡的使用量为0.8mL时，曲线的斜率变小，表明电极内部液体石蜡阻碍电子传递的作用强于萃取吸附作用；液体石蜡的使用量为1.0mL时，响应达到最大，随后峰信号随着液体石蜡的使用量增加迅速下降，其电阻亦迅速增大；液体石蜡的使用量为1.6mL时，峰信号降为0，表明此时液体石蜡在石墨粉表面已形成致密的膜，阻碍了电子的传导。因此，本实验在1.0g石墨粉加入1.0mL液体石蜡，制成碳糊电极最佳。
图2 杨梅素氧化峰电流（▲）及电极电阻（■）随液体石蜡加入体积的影响
Fig.2 Effect of added paraffin on resistance of working electrode and the main oxidation peak
3.2 杨梅素在碳糊电极上的直接电化学行为
在-0.2～1.0V的范围内，以100mV／s的速度对2×10-5 mol／L杨梅素的乙醇溶液作CV扫描，pH＝2.0。第一次循环在0.41，0.69和0.85V出现3个氧化峰；反向扫描时，在0.36和－0.11V处出现2个还原峰，如图3所示。
当CV扫描过峰1即回扫，出现还原峰4和一个极小的峰5。其中峰1与B环上羟基的氧化有关［7，8］，峰4和峰5对应B环羟基氧化产物的还原。杨梅素的峰形和芦丁的CV扫描图类似，但芦丁并未出现峰2［8］，对比杨梅素和芦丁结构，推测峰2对应C环3位羟基的氧化。根据文献［14～16］，推测杨梅素在碳糊电极上的反应有自由基生成，机理如下：
图3 2×10-5 mol／L杨梅素在的B－R缓冲溶液（pH 2.0）中的CV图
Fig.3 Cyclic voltammograms of 2×10-5 mol／L myricetin in pH 2.0B－R buffer
（a）第一次扫描，（b）第二次扫描；扫速100mV／s。
（a）first scan，（b）second scan；scan rate 100mV／s.
为证明步骤一具有高度可逆性，步骤二可逆性较差，考察了在起始电位为－0.2V时，不同的终点正电位与峰4氧化电流与峰1还原电流之比（iop／irp）的关系。当扫描范围在-0.20～0.80V时，随着扫描终点正电位（0.6～0.8V）的增加，iop／irp由0.934逐步下降至0.694。但当扫描终点正电位超过0.8V时，iop／irp急剧下降至0.368。若扫描终点正电位进一步增加，iop／irp将持续下降至0.1左右。
所以，推测峰应在第三种机理的第二个过程形成，即涉及到自由基获得一个电子，转变为对醌结构，氧化峰3对应于该歧化反应过程。
3.3 透过Nafion的质子对溶液本体的影响
为考察透过Nafion膜向层析液扩散的质子对溶液本体的影响，用外置三电极体系测定了流经检测装置前后层析液的CV图，没有显著的变化。进一步验证，将溶剂在装置中往复循环不同时间后，测其电导率。实验用水的电导率为1.2μS／cm。将10.0mL纯水与80%乙醇分别作为流动液测试，结果如表1。
实验表明，80%乙醇溶液循环流动1h，其电导率仅上升1.2μS／cm。考虑到层析检测时流经的时间极短，因此可认为在线测定时，从电解质腔室扩散至流动池腔室的H＋的量可以忽略，对溶液本体基本无影响。
3.4 流动相静止条件下杨梅素的CV曲线
将0.5mL杨梅素（4×10-4 mol／L）的80%乙醇溶液（V／V）注入检测装置的流动腔室中。在流动相静止条件下，测定CV曲线，如图4中的实线。与添加了支持电解质直接测得的CV曲线（图3）相比，其背景电流略有增大，但峰形基本一致。各峰位置略有迁移，其中响应最强的氧化峰1由原先的0.43V处，迁移到了0.53V的位置，还原峰5消失。
为验证Nafion膜表面的酸性质，考察了碳糊电极与Nafion膜之间不同距离（0.5，1.0和1.5mm）的情况，随着距离的增加，峰高急剧变小。如图4虚线所示，当间距为1.0mm时，信号谱图与本底无显著区别，表明Nafion膜具有表面酸性质，且短时间内质子向溶液本体扩散不明显。
表1 溶剂在装置中循环不同时间的电导率
Table 1 Conductivity of solvent flowing in cell for different time
3.5 流速对时间－电流曲线的影响
以恒流泵模拟柱层析液流出的情况，在恒电位0.53V下，测定了1.0，1.8和2.6mL／min不同流速下的时间－电流曲线图，结果如图5。
用Origin 8.1软件，对其进行基线校准，积分求面积，结果列于表2。与色谱峰类似，随着流动相流速的降低，存在峰形变宽的趋势。且由于测定的溶液处于流动状态中，在低流速下曲线受到蠕动泵的影响变大，毛刺增多，相对标准偏差也增大。
图4 流动相静止时，不添加支持电解质杨梅素CV图（——）在装置中直接测定；（－－－－－）碳糊电极离开Nafion膜1mm
Fig.4 CVs of myricetin without electrolyte while the mobile phase is still
Full line：distant between working electrode（WE）and Nafion：0.5mm；Dashed line：1mm.
图5 注入0.5mL杨梅素溶液后的电流－时间图，流速分别为1.0，1.8和2.6mL／min
Fig.5 Current－time response upon injection of 0.5mL of 4×10-4 mol／L Myricetin in 80%（V／V）ethanol－water，under the volume flow rate of 1.0，1.8and 2.6 mL／min，respectively
3.6 浓度与时间－电流曲线峰面积的关系
在0.53V下，分别测定了80%乙醇溶液中不同浓度杨梅素的时间－电流曲线，进样量为0.5mL，流速为1.8mL／s，基线校正后求得积分峰面积，结果如表3。
以浓度（C）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标作关系图，其线性关系为A＝2.7227C＋0.4341，r＝0.9976。因而可认为当杨梅素浓度在2×10-5～1 ×10-2 mol／L范围，峰面积与浓度存在线性关系，可作为定量分析的依据。
表2 不同流速下的时间－电流曲线峰面积
Table 2 Peak area of time－current curve at different flow rate
表3 不同浓度的杨梅素溶液的时间－电流曲线峰面积
Table 3 Integral peak area of different concentrations of Myricetin
3.7 大孔吸附树脂分离纯化竹叶黄酮电化学在线检测
为确定检测电位，将预提纯至70%的竹叶黄酮，配成2×10-5 mol／L溶液，注入流动池，不添加支持电解质直接测定其CV图，结果如图6。在0.37和0.80V处出现2个弱氧化峰，在0.62V处出现一个强氧化峰。在0.55和0.36V处出现两个略有重叠的还原峰。因此，将检测电位定为0.62V。
用该电化学检测器对竹叶黄酮在大孔吸附树脂纯化过程中进行了在线监测，采用蠕动泵分流连续抽样进入检测器的方式，流速为1mL／min，恒电位0.62V，采样间隔0.5s，结果如图7。其曲线的出峰时间、峰的极大值的时间、走势等，与现用的取样检测方法的洗脱曲线基本相符。
3.8 稳定性及重复性实验
工作电极分别经无水乙醇、0.1mol／L HCl与0.1mol／L NaOH浸泡后一定时间后，3次测定2.0 ×10-5 mol／L杨梅素溶液（pH＝2.0），获得峰电位与峰电流值，其平均值列于表4。其中，经醇、碱浸泡的电极，在10d以后，表面发生龟裂，不能获得数据。综合表4结果，可认为在不同时间进行测量，样品的峰电位、峰电流和峰型基本不变，显示出液体石蜡－石墨电极良好的稳定性。
在不同的pH值条件下，碳糊电极的最大稳定电位也各不相同。在pH为2.01，3.13，4.01，5.02，6.30和7.00条件下，增加正向电势至碳糊电极表面碳末变疏松、解离，其最大稳定电位分别为1.37，1. 45，1.50，1.55，1.65和1.78V，其在正电势区间的工作范围也较其他固态工作电极更广。
图6 竹叶黄酮在装置中的CV图
Fig.6 CV of antioxidant of bamboo leaves（AOB）in cell
图7 竹叶黄酮吸附纯化过程洗脱液的时间－电流曲线
Fig.7 Current－time response of spent regenerant during the absorption and purification process of AOB
表4 碳糊电极在不同介质中的稳定程度
Table 4 Stability of carbon paste electrode in different media
注（Note）：Pp.峰电位（Peak potential）；Pc.峰电流（Peak current）.
