光电化学生物传感器研究

1 引 言

随着社会的迅速发展，人类的健康问题也越来越受到关注。2018年6月6日世界卫生组织(WHO)发布了《2018世界卫生统计报告》(World Health Statistic 2018)，其中，在由于非传染性疾病导致死亡的案例中，恶性肿瘤以27%的比例成为最主要致死的病因。近年来，恶性肿瘤俨然已经成为威胁全民健康的头号杀手。然而，癌症并不等于死亡，治疗癌症的关键就在于发现早期肿瘤，主要途径有两个：一是通过早期肿瘤标志物的异常检测；二是找到合适的快速准确检测方法[1-4]。与此同时，光电化学生物传感器迅速兴起，并因其独特的优点成为一种备受瞩目的新型生物传感器[5-7]。光电化学生物传感器的出现，更能够实现将不能直接观察的早期肿瘤标志物的异常变化通过可见信号展现在计算机上，从而实现有效监测甚至诊断早期癌症的可能[8]。

1962年，英国科学家Clark等[9]提出将生物分子和传感器结合的设想，为生命科学研究开辟了新的道路。到二十世纪七十年代时，多种类型的生物传感器被研发出来，更引起了各个领域科学家的重视，使得生物传感器成为现代生物技术中的重要研究领域之一[8,10-11]。本文将主要介绍光电化学生物传感器。

2 光电化学生物传感器的概念及基本原理

2.1 光电化学生物传感器的概念

光电化学(PEC)过程是指在光的作用下，分子、离子以及半导体材料因吸收光子而使电子被激发而产生电荷传递的过程，同时实现了将光能转化为电能。光电化学生物传感器就是将光电化学与生物传感相结合，利用光电化学活性材料的转换特性而新兴的一种检测技术[12-13]。光电化学生物传感器定量检测早期肿瘤标志物，就是通过生物识别过程前后所产生的光电流或光电压的变化与待测标志物浓度之间的线性关系实现的。而光电化学检测实际上就是电化学发光检测的逆过程，光被作为激发源来激发光电化学活性材料产生电荷转移，随之产生的电信号用来作为检测信号[1-4,14]。

2.2 光电化学生物传感器的基本原理

光电化学生物传感器的基本检测装置及原理如图1所示[7]。检测装置使用传统三电极系统，包括一个工作电极(WE)、一个对电极(CE)和一个参比电极(RE)，三电极系统工作在合适的电解质溶液中[13]。通常，光电化学生物传感器的工作原理是：利用合适波长的光源照射激发修饰在生物传感器电极表面的光电化学活性材料，而当电极表面的目标识别元件同待测标志物结合后，发生新的氧化或还原反应，引起电荷的转移和电子的传输，从而形成光电流或光电压[12]。生物响应通过可见信号的形式呈现在计算机上，并且光电化学生物传感器检测的响应信号与待测标志物的浓度变化存在一定的函数关系[4-5,7]。因此，利用光电化学生物传感器检测信号的变化，我们可以预估计算目前标志物的浓度，从而实现对标志物的定量检测，这就是光电化学生物传感器的基本工作原理。

光电化学活性材料在被光激发时，吸收了大于其本身禁带宽度的能力，被激发产生的电子在光电化学活性材料内部的导带与价带之间转移，从而形成光生电子-空穴对[5]。具体的电子转移可以分为两种情况：(1)当修饰在光电化学生物传感器电极上的光电化学活性材料为n型半导体材料时，材料导带上的电子会转移到导电衬底上，电解质提供电子填充价带上产生的空穴，而光电化学生物传感器产生阳极光电流，如图2(a)所示；(2)当修饰在光电化学生物传感器电极上的光电化学活性材料为p型半导体材料时，材料导带上的电子会转移到电解质溶液中，导电衬底提供电子填充价带上产生的空穴，而光电化学生物传感器产生阴极光电流，如图2(b)所示。目前，大多数光电化学生物传感器能够产生可见信号都是基于这一原理。

图1 光电化学生物传感器的基本检测装置及原理图

Fig.1 Schematic of the general instrumentation and working principle of PEC bioanalysis

图2 (a)阳极光电流；(b)阴极光电流产生时发生电子转移的原理图。

Fig.2 Schematic of anodic photocurrent(a) and cathodic photocurrent generation and transfer mechanism of the electron(b)

3 光电化学生物传感器的分类及应用

光电化学生物传感器根据得到响应信号的不同，主要分为两类：电位型光电化学生物传感器和电流型光电化学生物传感器[10-11]。目前，电位型光电化学生物传感器已经被广泛应用在了各种生物领域，例如DNA、细胞、酶等。而电流型光电化学生物传感器近年来才刚兴起，但已经在酶传感器和免疫传感器上快速发展并成为主要的研究方向，本文将主要介绍电流型光电化学生物传感器的分类及应用。

对于电流型光电化学生物传感器，我们根据其电极是否修饰具有信号放大作用的标记物又将其分为无标记型光电化学生物传感器和有标记型光电化学生物传感器[4,5,7-8,10-13]。它们的区别在于是否修饰具有信号放大作用的标志物。如果电极修饰有信号放大作用的标志物，那测得的响应信号会得到进一步放大，更有利于下一步的检测和观察。与此同时，修饰具有信号放大作用标志物的有标记型光电化学生物传感器对于检测早期肿瘤标志物具有更高的灵敏度[5]。

3.1 无标记型光电化学生物传感器

无标记型光电化学生物传感器是将光电化学活性材料直接修饰在电极表面，不再修饰其他活性材料，直接测定抗原-抗体特异性结合时产生的信号变化。这种测试方法制备电极简便，因此，成为了免疫传感器的重要研究方向[4]。

Han等[18]设计了一种基于掺杂Ce的CdS纳米粒修饰石墨烯/BiYWO6光电化学活性材料，与纯的BiYWO6、石墨烯/BiYWO6、和BiYWO6/Ce∶CdS相比，这种新颖的材料更能够增强光电化学强度，制备过程示意图如图6所示。另外，抗坏血酸(AA)能够作为电子供体且无毒高效。Ce的掺杂提高了CdS的可见光吸收范围，促进电荷转移，增强电流响应，同时抑制电子-空穴复合。而且，由于石墨烯具有良好的电子收集和穿透特征，能够进一步促进载流子的分离和转移。在最佳条件下，这个光电化学生物传感器对于四环素的检测限能够达到0.01 ng/mL，同时具有良好的可重复性、选择性和稳定性。

Chen等[16]采用胶体自组装、气相沉积和脉冲激光沉积等先进技术制备出新型高质量ZnO IOPC/Ag/NaYF4∶Yb，Tm复合薄膜，用于检测甲胎蛋白。在该复合薄膜材料中，ZnO反蛋白石和银的表面等离子体共振反应能很大程度上增强NaYF4∶Yb，Tm的局域激发电磁场，从而产生高效的近红外/可见/紫外上转换发光(UCL)[17]。NaYF4∶Yb，Tm激发产生的紫外光进一步被ZnO反蛋白石结构吸收，产生光电化学响应，该光电化学生物传感器的基本制备和检测原理如图4所示。此外，由于ZnO反蛋白石结构具有更高的比表面积以及银膜的电导率良好，该传感器显示出了对甲胎蛋白的超灵敏检测，线性范围为0.05～100 ng·mL-1，最低检测限为40 pg·mL-1。这种光电化学生物传感器对于其他癌症标志物的检测也具有着临床与生物学分析应用前景。

图3 (a)NPC-ZnO纳米多面体的制备原理图；(b)以NPC-ZnO纳米多面体型材料制备的光电化学生物传感器检测碱性磷酸酶。

Fig.3 (a) Schematic diagram for the preparation of NPC-ZnO nanopolyhedra. (b) Mechanism of nPC-ZnO nanopolyhedra-based photoelectrochemical biosensor for alkaline phosphatase(ALP) assay.

Yang等[15]制备了新型的NPC-ZnO纳米聚合多面体型光电化学活性材料，将其修饰在ITO导电玻璃上作为电极，用来检测碱性磷酸酶，制备原理如图3所示。制备出的NPC-ZnO纳米聚合多面体是菱形十二面体形貌，粒径约为100 nm，比表面积为609.2 m2·g-1。在可见光照射下，NPC-ZnO纳米聚合多面体在抗坏血酸的水溶液中表现出比ZnO纳米棒和ZIF-8纳米多面体更好的光电化学性能。在最佳检测条件下，这种基于NPC-ZnO纳米多面体的光电化学生物传感器，其线性范围为2～1 500 U/L ，最低检测限为1.7 U/L。此外，这种光电化学生物传感器具有理想的选择性、重复性和稳定性，在光电化学分析重金属离子、有机污染物和生物分子方面也具有广阔的应用前景。

无标记型光电化学生物传感器制备的关键就在于制备出具有良好性能的光电化学活性材料，最好选用无毒、易制备、低成本的材料。

图4 (a)用ZnO/Ag/NaYF4∶Yb，Tm电极检测AFP的原理图;(b)980 nm光激发下光电化学免疫分析原理示意图。

Fig. 4 (a) Schematic illustration of the fabrication of ZnO/Ag/NaYF4∶Yb,Tm electrodes for AFP detection. (b) Schematic illustration for principles of the photoelectrochemical immunoassay under 980 nm light excitation.

图5 无标记型光电化学生物传感器的构建过程

Fig.5 Construction process of the label-free PEC aptasensor

3.2 有标记型光电化学生物传感器

有标记型光电化学生物传感器是在无标记型光电化学生物传感器的基础上，对检测前的待测物进行信号放大元件标记物修饰，也可以通过检测信号放大元件标记物的变化来监控免疫过程。

Wang等[14]以WO3/CdS/PDA纳米复合材料作为光电化学活性材料，制备出了双抗体结构的免疫传感器，如图6所示。其中，PDA@carbon纳米管就是这个标记型光电化学生物传感器的信号放大标记物，同时WO3/CdS/PDA复合结构也增强了光电流响应。这种夹层型光电化学生物传感器有良好的线性关系，在最佳条件下，检测浓度范围达到0.01～50 ng·mL-1，最低检测限是2.8 pg·mL-1。该传感器具有良好的特异性、可重复性和稳定性，有望在胰岛素或其他生物标志物的临床诊断中得到应用。

图6 夹层型光电化学生物传感器的制备原理图

Fig.6 Schematic of fabrication of the photoelectrochemical sandwich biosendor

Chen等[19]以纯CdSe量子点作为光电化学活性材料，将其修饰在电极表面，制备了层层型光电化学生物传感器用于检测α-AFP，制备过程如图7所示。其中，链霉亲和素(SA)作为信号捕捉单元，生物素功能化的去铁蛋白包覆抗坏血酸(Bio-APOAA)作为信号放大标志物，组装在电极上。该传感器是基于Bio-APOAA的原位酶释放出抗坏血酸(AA)作为电子供体而产生光电流的原理实现检测甲胎蛋白。传感器对α-AFP的检测具有较高的选择性和较好的灵敏度。在最佳条件下，线性范围为0.001～1 000 ng/mL，最低检测限为0.31 pg/mL。该免疫传感器有望用于临床实验室检测人血浆中AFP和其他肿瘤标志物，用于癌前筛查或癌症监测。

图7 (a)用CdSe量子点制备光电化学生物传感器检测甲胎蛋白;(b)电子转移机制。

Fig.7 (a) Photoelectrochemical biosensor for α-AFP detection based on CdSe. (b) Electron transfer mechanism.

Wang等[20]构建了一种检测前列腺特异性抗原(PSA)的超灵敏夹心型光电化学免疫生物传感器，构建过程如图8所示。将金纳米粒(Au)负载到海胆状的WO3表面作为光电化学活性材料，再将Ca粒子掺杂到CdSe上，同时与还原氧化石墨烯(rGO)结合，作为信号放大探针。在这个光电化学生物传感器中，Au纳米粒能够与抗体的—NH2化学键结合，固定住更多的抗体，同时加入rGO和Ca粒子可以有效提高CdSe纳米粒子的导电性，抑制电子-空穴的复合，从而提高光电流转换效率。构建过程中，将抗体固定在WO3-Au涂层的基底上，经特异性抗体-抗原相互作用将制备的rGO-Ca∶CdSe标记物捕获固定在电极表面，利用敏化作用进一步增强光电流强度。在最佳检测条件下，制备的这种光电化学免疫生物传感器检测到的光电流变化与PSA浓度的对数呈线性关系，检测范围为5 pg/mL～50 ng/mL,最低检测限为2.6 pg/mL(S/N=3)。此外，它还具有良好的稳定性和特异性，表明这种光电化学免疫生物传感器在临床诊断中具有应用潜力。

图8 光电化学夹心型免疫生物传感器的构建过程

Fig.8 Construction process of the photoelectrochemical sandwich immunosensor

4 光电化学生物传感器发展展望

癌症发病率的升高所导致的死亡率的增高，对于生命安全造成莫大威胁，因此，癌症的早期检测对于及时发现病症并作出合理治疗起着非常重要的作用[18,21]。而光电化学生物传感器这种新兴的检测技术，因其检测背景低使得它具有非常低的检测下限，因此光电化学生物传感器优于传统的电化学传感器、光学传感器以及酶传感器等[1,20,22-25]。再加上光电化学生物传感器的设备操作简单，成本相对较低，因此可以继续研究应用到早期癌症的检测诊断，甚至可以设计便携式仪器更方便检测。因此，寻找更多适合于光电化学生物分析的光催化材料，探索具有更高外量子效率的材料，从而提高光电化学生物传感器的灵敏度[5]。此外，应该更详细地研究和设计光电化学生物传感器中的纳米生物界面，开发出更简单的生物分子固定方法，使光电化学生物传感器具有长期稳定性和优越性，以便实现光电化学生物传感器的商业化应用[5,7,26]。