摘 要：为了喷射细胞并保持高的细胞活性，设计并搭建了一套基于气动阀控技术的微液滴按需喷射装置. 该装置主要部件包括储液腔体、位于腔体底部的100 μm直径喷嘴、以高速电磁阀和放气管为核心的气路以及液滴拍照系统. 该装置利用高速电磁阀产生气体压强脉冲，迫使储液腔内液体挤出喷嘴，形成液滴；气体随后经放气管排出，恢复储液腔内气压平衡. 经拍照系统验证，该装置实现了稳定的单液滴喷射，喷射频率可以达到20 Hz，液滴直径约200 μm，实现了对人外周血淋巴细胞和培养基的喷射. 流式细胞检测显示，细胞经喷射过程的存活率接近100%.
关键词：按需液滴喷射； 气动； 细胞打印； 人外周血淋巴细胞； 流式细胞术
如何产生大小可控、运动轨迹可控的微米尺寸单液滴是重要的科学技术问题，并已经应用在多个科学技术领域[1-2]. 在生物医学领域中，微液滴可以作为细胞荧光分析和分选的载体[3]. 微液滴喷射是重要的微量样本施加技术，对于样本特别稀少或者珍贵的情况，微量样本施加技术不仅降低样本用量从而降低成本，而且样本微米化导致的界面- 体积比增加会更加促进反应速率的提高[4]. 生物3D打印和组织工程领域的快速发展为基于微液滴喷射的样品精准施加技术提供了新的广阔的应用前景[5-6]. 细胞图形化(cell patterning)利用喷墨打印的方式制备出细胞亲和材料的二维图案，帮助细胞附着和生长[7]. 细胞打印(cell printing)则是更加直接的技术，将包含细胞的“生物墨水”精确地、“按需”地喷射在指定区域.
常见的按需微液滴喷射装置一般采用压电驱动、热泡驱动、静电驱动、气动阀控等技术[1-2,8]. 生物细胞打印可通过改装商业打印机的阵列喷头实现. 美国Boland等[9-10]改装商用的喷墨打印机，实现了微液滴细胞喷射(喷头基于热泡驱动). 虽然研究发现细胞裂解率低于10%，但是喷头局部温度估计达300 ℃，对细胞潜在的影响并没有进一步报道. 近年来，商用喷墨打印机日益提高的分辨率使得喷口很小，用于改装来喷射细胞的难度加大，细胞样品堵塞喷口的情况难以避免[11]，且细胞样本在腔体中会逐渐沉淀，导致细胞打印浓度随时间发生变化，加剧喷口堵塞. 因此，通过改造商用喷墨打印机的细胞打印系统难以解决这些问题. 基于压电驱动的微液滴单喷头[12]也可被用于细胞的喷射[13-14]. 压电驱动虽然原理简单，可以实现极高的喷射频率(10～30 kHz)，但是实际操作中工作参数的设定比较复杂，而且喷射液体的黏度不能过大. 过高的喷射频率也使得喷射与三维定位平台的同步难度加大.
气动阀控喷头是利用高速阀门产生气体压强脉冲，迫使储液腔内液体挤出喷口，形成液滴. 储液腔内气体随后快速释放，液流回返并复原. 气动阀控喷头工作原理简单，尽管喷射频率较低，但是工作稳定，可以喷射的液体黏度范围非常宽泛[15]，非常适合实验室工作条件. 气动阀控喷头最早用于喷胶和高温金属微液滴的产生，近年也被应用于生物、农业领域[16]. 本文介绍了自行搭建的气动阀控微液滴喷射系统，将该系统用于人外周血淋巴细胞喷射的初步试验，并采用流式细胞检测研究了喷射过程对细胞活性的影响.
1 装置与方法
1.1 气动阀控微液滴喷射原理
按需微液滴喷射的基本原理是通过内部换能器或外部激励在储液腔内的液体中产生压强脉冲，将液体挤出微米大小的喷嘴. 基于该原理的气动阀控的微液滴喷射系统如图1所示，电磁阀快速开启，随后快速关断，气体(严格讲是部分气体，因为会有一定气体直接由放气管排出)冲入储液腔内产生正压强脉冲，在喷嘴处形成条形液带. 流体的不稳定性导致液带的末端断裂，形成液滴. 增加气源压强或者延长电磁阀开启维持时间都会增加腔内压强脉冲的幅度，从而增加液带的长度. 当液带过长时，液带会断裂成2个或者更多个液滴. 描述液带断裂为液滴的线性稳定性分析模型可以参考文献[17].
图1 实验装置原理图
Fig.1 Schematic diagram of the experimental apparatus
如图2(a)(b)所示，电磁阀关闭后，储液腔通过T型接头和排气管联通大气. 这个结构可以近似地看成一个亥姆霍兹共振腔[17-18]. 而文献[17]的研究显示，腔内压强迅速振荡并衰减,如图2(c)所示. 随后若干个周期储液腔内压强会低于大气压，最后腔内外气压会趋于平衡. 正压使液体从喷嘴喷出形成液带，而负压则有助于液带断裂形成液滴，并促使未断裂的液带重新返回储液腔内. 储液腔内压强振荡频率即亥姆霍兹共振腔的振荡频率f0，可以表示为
初帅、孟凡强(2017)[13]的研究用个体小时工资对数作为收入因变量，但考虑到农村劳动时间的特殊性以及收入指标的准确性要求，本文选取个人全年总收入作为收入变量，并且为了实现不同年份数据的可比性，运用居民消费价格指数(CPI)对收入变量进行调整。
(1)
式中：c=343 m/s，为声速；S、l、d分别为放气管的截面积、长度和直径；V为储液腔的有效容积(储液腔内液面以上的有效容积)，如图2(a)(b)所示.
继2016年9月“首届黑龙江流域文明暨俄罗斯远东历史文化与社会发展论坛”、2017年6月“第二届黑龙江流域文明暨俄罗斯远东历史文化与社会发展高端论坛”之后，第三届黑龙江流域暨远东学术研讨会在金秋时节的龙江之滨黑河学院顺利召开。本次研讨会由黑河学院远东研究院主办，秉承和延续前两届学术论坛所确立的学术传统，继续以黑龙江流域文明研究为核心，进一步明确研究目标，深化研究领域，加强了国际学术界信息的交流互通，并首次邀请蒙古国一流专家学者参与论坛报告与讨论，使论坛学术水准再上新的台阶。
图2 亥姆霍兹腔体及其振荡示意图
Fig.2 Schematic of Helmholtz resonator and Helmholtz oscillation
如图1、2所示，储液腔和气路的几何尺寸决定了亥姆霍兹共振腔的振荡频率. 根据式(1)可知，减小储液腔的容积，缩短放气管的长度都可以提高f0. 根据1.2节的系统设计的具体参数不难计算出f0为130 Hz左右. 液滴喷射频率应该低于f0数倍，以保证在下次喷射前储液腔内外气压基本恢复平衡.
1.2 喷射系统的设计与实现
微液滴喷射装置应该工作稳定，且易组装、拆卸与清洗，同时需要操作简单，适合不同浓度、黏度的液体，又能满足微量喷射的需求. 根据这个原则，设计了气动阀控微液滴喷射装置，如图1所示. 该装置主要分为储液腔、喷嘴、气路和拍照系统4个部分. 每个部分都是模块化的，通过改变不同的模块，就可以适合不同性质的液体.
1.2.1 储液腔
该部分由圆柱形侧壁和上下两块面板组成. 侧壁材料是亚克力玻璃，因其透明，易观察内部情况；又因其稳定，不会与待喷射液体样品发生反应. 圆柱形高为60 mm，外径为45 mm，内径为25 mm，壁厚10 mm. 上下面板厚度为10 mm. 通过O型硅胶垫圈与侧壁连接为一个整体. 上面板提供一个T型快插接头的接口和一个进液口，下面板提供一个与喷嘴连接的接口.
1.2.2 喷嘴
喷嘴为带有微孔的陶瓷片. 喷嘴通过密封垫片固定在储液腔的下面板上. 喷嘴是整个系统的关键部分，主要决定着喷出液滴的尺寸. 本实验喷嘴孔径为100 μm. 需要注意的是对喷嘴外表面和喷孔内壁的疏水处理至关重要. 喷孔内壁的疏水性可以有效地防止液体渗漏；而喷嘴外表面的疏水性能有效防止液体在喷孔外侧累积，减小喷射阻力，提高喷射质量. 喷嘴的疏水化采用的是中国科学院重庆绿色智能技术研究院崔月华和曹良成提出的方法[19]，实验结果表明：这样的疏水处理有效地提高了液滴喷射的稳定性.
由于城市副中心的提出，将使中心城市的人口向城市副中心地区转移，副中心地区的城市功能区域也将进一步扩张，意味着部分城市副中心周边的原有的农村公路也将被大量补充进城市功能区范围内，从而导致其周边农村公路的服务对象有所不同，以往的农村公路仅仅服务于规划区域内部，是一个相对独立的系统，而城市副中心周边的农村公路规划将站在整个城市的角度去进行路网的设计，要考虑与整个城市的路网相协调，服务于整个城市. 目前，农村公路的规模及功能均无法满足副中心建设需求. 因此，道路功能的划分将从以往的通乡镇、通村的农村公路转化成城市道路，实质上意味着城市副中心周边的农村公路要兼顾城市道路的功能.
1.2.3 气路
储液腔和喷嘴以外的气路部分由气源、减压阀、精密调压阀、电磁阀、T型快插接头、放气管等部件组成. 气源是高压氮气，输出有效气压范围为0.5～15 MPa，经过减压阀、精密调压阀，最终的输出气压范围是0～400 kPa. 电磁阀的作用是产生一个极短的气压脉冲. T型快插接头提供气体进出储液腔的通路如图1所示，其一端接一根80 mm长、外径6 mm、内径4 mm的放气管，另一端连接电磁阀. 电磁阀是气路部分的关键元件. 本实验中采用的是美国MAC公司的高速电磁阀，型号为34C-ABA-GDFA-1KA. 其额定电压为24 V，标称开启时间为3.5 ms，关断时间为1.5 ms. 为了进一步提高电磁阀的开启和关断速度，实验中专门设计了相应的电磁阀加速电路. 其原理是在电磁阀开启阶段，对电磁阀施加极短的数倍于额定电压的高电压，增加其瞬时电流变化率，在更短的时间内产生足够的吸力使电磁阀开启；在随后的维持阶段，将电压切换到额定电压，避免损坏电磁阀；在关断阶段，通过快速放电电路，加速关断过程. 经过测试，电磁阀的开启时间降至1.5 ms，关断时间降至1.0 ms.
1.2.4 拍照系统
1.2.4 差异表达蛋白-蛋白间的相互作用分析 利用线上工具STRING数据库(www.string-db.org)绘制蛋白-蛋白间的相互作用(protein-protein interaction，PPI)分析网络。STRING(version 10.0)覆盖了包括人类在内的2 031个生物种类，涉及了9 643 763种蛋白[4]。将所有DEG录入STRING数据库，如果PPI的可信评分>0.4(中等以上信度)，则视为两者可能有结合。将这些可能有相互作用的蛋白导入Cytoscape 3.4.0软件，重新绘制蛋白相互作用网络示意图，筛选出与更多蛋白相互作用的中心节点蛋白。
该部分主要由一个高亮度LED灯和一个高灵敏度工业相机组成. 目的是监测液滴喷射的状态以及记录液滴下落的轨迹. 拍照采用逆光拍摄的方法，利用液滴的产生及下落过程具有优良重复性的特点[1]. LED光源始终开启，设定相机触发信号相对于电磁阀驱动信号的时间延迟，通过在一系列不同延迟时间下拍摄，即可以记录液滴产生的不同阶段，如图3所示. 值得强调的是，图3所示的一组图是对一系列不同液滴延迟不同时间拍照得到的，描述了从液带挤出喷孔到液滴下落一段距离的整个过程. 实验中，光源选择的是高亮度白光LED；相机是大恒公司生产的高灵敏度黑白工业相机：CCD尺寸为6.35 mm，像素尺寸为5.6 μm×5.6 μm，分辨率为656×492，最短曝光时间为12 μs；光学系统采用Navitar公司的6.5×倍变焦透镜系统，放大率可调(0.7～4.5×放大调节范围). 注意到液滴的尺寸为100～200 μm，下落的速度最大不超过0.5 m/s(见图4). 相机在12 μs的曝光时间内最多只会产生一个6 μm的拖影，相对液滴的尺寸可以忽略. 这一点在实验拍摄结果(见图3)中也得到了证实.
图3 液滴喷射过程
Fig.3 Process of the droplet generation
图4 液滴喷射速度测量曲线
Fig.4 Droplet ejection velocity measurement curve
2 实验
实验中为了得到稳定的初始喷射条件，首先设定较低的喷射频率为1 Hz. 同时，在电磁阀前端的气路中设定较高的压强(105 kPa)以及较长的电磁阀开启维持时间(4 ms)，这2个条件使得储液腔内压强脉冲的起始幅度足够高，确保液体能够喷出并形成液滴. 经过观察，在上述条件下，从喷嘴喷出的不是单液滴而是一串液流. 通过减小气压，减短气压脉冲宽度的措施，得到了在频率1 Hz下稳定喷射的条件为：气体压强85 kPa，气压脉冲宽度3.5 ms. 之后只需要提高喷射频率，系统就能稳定工作. 实验结果表明：这套微液滴喷射装置的稳定喷射频率可以达到20 Hz. 图3显示了拍照系统记录的一个喷射周期内液滴产生的过程，被喷射液体为去离子水；其中喷射条件如前所述，喷射频率为15 Hz. 系统实现了稳定的单液滴喷射. 液滴直径大约为200 μm[17]. 图4显示了液滴下落位移随时间的变化，近似以线性函数拟合. 拟合得出液滴喷射初始速度大约为0.25 m/s.
实现单液滴喷射后，尝试了用此液滴喷射系统喷射细胞，并初步研究了喷射过程对细胞存活的影响. 取人抗凝外周血1份，以密度梯度离心法分离外周血淋巴细胞(PBL)，以2 mL培养基重悬细胞后取出1 mL，细胞个数约为106个，加入腔内. 细胞直接喷射至样品管内(管内加0.5 mL磷酸盐缓冲液)，获得样本B. 将未经喷射细胞作为对照样品A. 各加入1 μL 7AAD(7-amino-actionmycin D)进行荧光抗体染色，染色15 min后使用流式细胞仪进行流式检测，根据荧光表达强度计算细胞存活率. 如图5所示，样品A、B分别为未经喷射过程和经历了喷射过程的细胞样品. 图5(a)(c)中FSC-H和SSC-H分别为前向散射光和侧向散射光相对强度，椭圆形门内的数据点对应PBL，样品A、B中PBL占比分别为50.2%、53.1%，差异合理. 图5(b)(d)纵坐标为指示细胞凋亡的7AAD荧光染料的相对荧光强度，方形门内数据点表示7AAD呈阴性(7AAD(-))的细胞，即具有活性的细胞. 从图中可以看出，喷射前后PBL的存活比例分别为99.1%、99.3%，差别无统计学意义，表明喷射过程对细胞活性无影响.
图5 样品细胞喷射前后对照图
Fig.5 Control plot of sample cells before and after injection
3 结论
1) 本文设计和搭建了一套基于气动阀控的微液滴喷射装置，喷孔直径100 μm. 本实验中，设置气压85 kPa，脉冲宽度3.5 ms，喷射频率15 Hz. 经拍照系统验证：实现了单液滴喷射，其中液滴直径约200 μm，液滴喷射速度约0.25 m/s，喷射稳定. 以上述条件喷射了人体外周血淋巴细胞和培养基混合液，经过流式细胞测量，表明喷射过程对细胞成活率影响可以忽略. 本实验利用气动阀控微液滴喷射技术实现单液滴细胞喷射，细胞成活率高于采用热泡驱动、静电驱动、压电驱动等技术的细胞喷射. 实现高成活率的可能原因包括液滴初速度低、液滴较大等. 因此，基于气动阀控的细胞喷射有望成为细胞打印的可行性技术方案.
接车后，首先验证故障现象。关闭点火开关并且拔出钥匙后，仪表盘上各个指示灯一直点亮，无法断电，插入钥匙后再次启动发动机，启动机不工作。只有先将断开蓄电池电源后再重新接上后，重新拧点火开关，启动机才会工作，且可以正常着车。再次关掉点火开关，则发动机无法正常熄火。
斯洛文尼亚国境内分布着大量石灰岩，千百万年来，积水溶解了岩石中的碳酸钙，形成了由隧道和洞穴构成的“地下迷宫”。最早来此进行地质勘探的德国科学家将这种岩溶地貌称为“喀斯特”，这一名称至今仍在地质学界沿用。最常被人们光顾的洞穴当数斯科契扬溶洞群。这是一个由石笋、钟乳石和石柱组成的童话世界，其地下峡谷的恢宏壮观使之居于世界最著名的喀斯特地貌之列。
2) 气动阀控液滴喷射的主要不足在于其喷射频率较低. 后续的工作将着重提升喷射频率，主要可以从2个方面入手：一方面，选择更加高速的电磁阀，并辅助以电磁阀加速电路，进一步缩短电磁阀的开启和关断时间；另一方面，提高亥姆霍兹共振器的振荡频率，与更快的电磁阀相匹配. 同时优化亥姆霍兹共振器结构，加速气压振荡的衰减过程，使腔内气压在更短时间内恢复平衡，从而减小相邻2个喷射脉冲间的相互影响. 利用微秒级高速压力传感器测量储液腔内的气压波形，再以流体力学模拟辅助，有望实现上述目的.
