环草石斛和铁皮石斛试管苗叶片气孔特征比较

气孔是植物叶片与外界环境进行气体和水分交换的主要通道，对植物生理活动起着重要的调节作用，气孔的数量组成与气孔的开闭对植物光合、呼吸和蒸腾作用具有重要意义［1－2］。气孔是重要的植物学性状之一，其遗传稳定性较强。研究表明，气孔与植物的生长势、抗性、亲缘关系和染色体倍性等存在相关性［3］。气孔在植物遭受环境胁迫时会作出各种响应以减轻胁迫，从而提高植物的抗逆性。虽然叶片上气孔的孔道面积只占叶片面积的1% ～3%，但通过气孔散失的水分则相当于叶片表面总蒸散水分的50% ～75%［4］。在植物遗传育种及资源研究等领域，气孔性状受到越来越多学者的关注。石斛是名贵的中药材，名列“中华九大仙草”之首。由于石斛野生资源匮乏，已被列为中国三级珍稀濒危保护植物。环草石斛(Dendrobium loddigesii Rolfe.)和铁皮石斛(Dendrobium candidum Wall.ex Lindl.)自然繁殖率低，植株生长缓慢，更新恢复周期长，而目前人工栽培技术还很不成熟，优质种苗的来源与供应已成为制约石斛产业发展的“瓶颈”。目前，有关药用石斛试管苗生理生态机制方面的研究较少，而有关石斛试管苗气孔特性方面的研究尚未见报道。笔者对环草石斛和铁皮石斛不同生长发育时期和不同光照培养条件下试管苗叶片的气孔进行扫描电镜观察，并测定其荧光诱导光响应曲线，分析比较了2种药用石斛试管苗叶片的气孔特征和光合特性，为揭示试管苗生长发育的生理生态机制奠定理论基础，为药用石斛的研究提供形态学资料。

1 材料与方法

1.1 材料 环草石斛和铁皮石斛的种子由贵州吉仁堂药业公司提供。环草石斛和铁皮石斛的种子经消毒后，在无菌条件下分别撒播在种子萌发培养基(MS+NAA 0.2 mg/L+2%白砂糖+15%马铃薯提取液+琼脂粉)表面，待萌发生长120 d后，选取长势和大小一致的幼苗，转接到生根壮苗培养基(MS+NAA 0.5 mg/L+3%白砂糖+20%马铃薯提取液+活性炭1‰+琼脂粉)上，接种密度10株/瓶，培养条件为光照强度27 μmol/(m2·s)，光照时间12 h/d，温度(25 ±2)℃。最后取播种后生长180、240、300 d时的环草石斛和铁皮石斛试管苗作为供试材料。当环草石斛种子播种萌发生长120 d后，另选苗高约0.5 cm，1～2片真叶，0～2条短根的试管苗转接到生根壮苗培养基上(培养基同上)，接种密度10株/瓶，分别进行 18、36、54 μmol/(m2·s)的光照处理，每处理接种30瓶，光照时间为12 h/d，温度为(25±2)℃，最后取光照处理60和120 d的试管苗作为供试材料。

图1 环草石斛和铁皮石斛试管苗叶片气孔器
Fig.1 Stomatal apparatus of test tube seedlings of D.loddigesii and D.candidum

1.2 方法

1.2.1 气孔形态的电镜观察。选取环草石斛和铁皮石斛试管苗茎尖下的第3片叶片，靠近中脉剪取0.2 cm2的小块，将样品放在3%的戊二醛中固定24 h，蒸馏水冲洗，再用1%的锇酸固定，乙醇梯度脱水，进行CO2临界点干燥及喷金。处理后的样品用日立S-570型扫描电镜观察叶背面，放大倍数150～2 000倍。

1.2.2 气孔大小和气孔密度测定。每份材料在放大300和500倍的条件下，随机选择30个气孔，测定气孔长轴(通常指气孔口纵径)、气孔器长轴、气孔器短轴。每份材料在放大150、200、300倍的条件下，各选取3个单位面积，统计气孔数量，换算成气孔个数/mm2，测量平均值。

1.2.3 气孔开放率和气孔指数测定。每份材料在放大150、200、300倍的条件下，各选取3个单位面积，分别观察和测定气孔开放率。气孔指数的计算公式:SI=［S/(E+S)］×100，式中，S为单位叶面积气孔数，E为相同叶面积表皮细胞数［5］。

1.2.4 ETR-PAR荧光诱导光响应曲线的测定。分别对播种后生长6、8、10个月的环草石斛和铁皮石斛试管苗叶片进行随机取样。用PAM-2100脉冲调制式荧光仪(Portable Chlorophyll Fluorometer;德国Heinz Walz GmbH公司生产)与电脑联用，在室温下进行光响应曲线测定，每个处理重复3次。数据处理用PAMwin软件进行。

2 结果与分析

2.1 试管苗生长发育过程中叶片气孔特征的变化 叶片气孔的大小和气孔指数的高低能够反映植物的生理生态学特性。从表1和图1可以看出，环草石斛和铁皮石斛试管苗叶片气孔均为卵圆形，气孔以一定的间距分布在表皮细胞之间。2种石斛试管苗叶片气孔长轴和气孔器短轴差异不显著，但铁皮石斛试管苗气孔器的长轴明显大于环草石斛，气孔器长轴与短轴之比，环草石斛为1.18，铁皮石斛为1.53。在各个生长时期，环草石斛的气孔密度均明显高于铁皮石斛，而气孔开放率则较低，两者的气孔指数相近，差异不显著。由表1可知，随着生长时间的延长，环草石斛试管苗叶片气孔器逐渐变长，气孔器长轴增加了16%，气孔密度增加了83%，气孔开放率呈先增加后减少的趋势，气孔指数则先减小再增加;而铁皮石斛试管苗气孔长轴、气孔器长轴和气孔器短轴变化都不大，气孔密度增加了17.6%。2种石斛试管苗均以播种后生长240 d时叶片开放的气孔数量最多，气孔指数最低。

表1 环草石斛和铁皮石斛试管苗不同生长时期叶片的气孔特征
Table 1 Stomatal characteristics of test-tube seedlings of D.loddigesii and D.candidum at different growth and development stages

2.2 光照强度对环草石斛试管苗叶片气孔特征的影响除进行景天酸代谢的植物外，大多数植物的气孔都是白天开放，夜间关闭，且表现出内源的开张和关闭的昼夜节奏。光对气孔开放的效应，不是通过光合作用使胞间CO2浓度下降而引起的，而是光的直接效应。使用希尔反应抑制剂抑制光合作用，气孔开度仍随光强增强而增大。结果表明，石斛虽是兼性景天酸代谢(CAM)植物，但其景天酸代谢现象在自然界中仅在晴天中午发生光胁迫的情况下才会发生，在阴天时一般不会发生，由于组培室的光照强度较弱，所以环草石斛和铁皮石斛试管苗以C3代谢为主。由表2可知，光照处理60和120 d的环草石斛试管苗叶片气孔的各项指标均随光照强度的增大而增加。随着光照强度的改变，2个处理时间环草石斛叶片气孔的变化规律相同。当光强为18 μmol/(m2·s)时，叶片气孔萎缩凹陷，气孔开放率为0，气孔大小、气孔密度和气孔指数最小;当光强为54 μmol/(m2·s)时，气孔各项指标值均最大。

2.3 ETR光响应 由图2可知，在生长发育过程中，环草石斛试管苗的最大电子传递速率(ETRmax)呈下降趋势，ETR最大值为14 μmol/(m2·s)左右，光饱和点除生长10个月时为149 μmol/(m2·s)，其他生长时期试管苗的光饱和点均在318 μmol/(m2·s)左右。铁皮石斛试管苗的ETR最大值明显高于环草石斛，均在20 μmol/(m2·s)以上，光饱和点在483 μmol/(m2·s)左右。表明铁皮石斛潜在的光合作用能力较强，且生长发育过程中光饱和点和ETRmax变化相对较稳定，而环草石斛潜在光合作用能力明显低于铁皮石斛。

图2 环草石斛和铁皮石斛试管苗荧光诱导光响应
Fig.2 Fluorescence induction response curve of test tube seedlings of D.loddigesii and D.candidum

3 结论与讨论

环草石斛和铁皮石斛试管苗叶片气孔均为卵圆形，气孔以一定的间距分布在表皮细胞之间。铁皮石斛试管苗气孔器的长轴明显大于环草石斛。在各个生长时期，环草石斛的气孔密度均明显高于铁皮石斛，而气孔开放率则较低。说明环草石斛试管苗在气孔开放率不高的情况下，以较多的气孔数量来提高其生理活性。该研究结果表明，环草石斛试管苗叶片气孔指数的变化与其光合速率的变化趋势相一致，而铁皮石斛气孔开放率的变化与其光合速率的变化趋势相一致，这可能是由于不同种类试管苗气孔发育速度不同，进而对其光合速率产生了不同的影响。在生长发育过程中，环草石斛和铁皮石斛试管苗叶片气孔的大小变化不大，而气孔的数量则逐渐增加，气孔密度分别增加了83.0%和17.6%。随着生长时间的延长，2种石斛试管苗气孔开放率呈先增加后减少的趋势，两者均以生长8个月时叶片的气孔开放率最高，而气孔指数最低。

表2 不同光照条件下环草石斛试管苗叶片的气孔特征
Table 2 Leaf stomal characteristics of D.loddigesii test-tube seeding under different light intensities

光照强弱显著影响叶片的气孔密度、气孔大小和气孔的生理活性，这与孟雷等［6］的研究结果相一致。由于气孔开度与光合作用的底物CO2的浓度直接相关，因此光照强度直接影响光合速率。在设定的3种光照强度下，环草石斛试管苗叶片气孔开放程度随光强的增加而增大，当光强为18 μmol/(m2·s)时，叶片气孔萎缩凹陷，气孔开放率为0，气孔大小、气孔密度和气孔指数最小;当光强为54 μmol/(m2·s)时气孔开放程度最大，对CO2运输至叶肉细胞的阻力也最小。该研究结果表明，18 μmol/(m2·s)的光照强度过低，不利于环草石斛播种生长6个月以后试管苗的生长发育。

光合作用碳循环的原料CO2主要是通过气孔进入叶肉细胞中，因此气孔的特性与光合速率密切相关。石斛试管苗叶片的气孔开度随光强增强而增大，表明提高光强有利于提高光合速率。为了节约生产成本，通常组培室内的光强不足27 μmol/(m2·s)，此条件下，2种石斛试管苗叶片气孔的开度都未达到最佳状态。所以生产中若能遵循石斛试管苗对光照条件的要求，选择合适的培养条件，增大气孔开度，提高光合速率，将更有利于试管苗的生长发育。

电子传递速率能够反映植物的光合速率。在弱光范围内，非环式电子传递速率ETR与光强呈线性正相关，直至光强增强到一定水平，所吸收的光强超越了电子传递能力后，即光强不再是限制因子后，ETR便不再随光强的增加而增强，当碳循环、光呼吸、氮同化及Mehler反应均达到最大值时，电子流的速度也达到最快，此时的ETR便达到最大值。因此从某种意义上来说，正常情况下ETR光响应曲线与叶片气体交换的光响应是等效的。该研究结果表明，在相同培养条件下，环草石斛试管苗的最大电子传递速率14 μmol/(m2·s)和光饱和点318 μmol/(m2·s)均低于铁皮石斛20、483 μmol/(m2·s)，其潜在的光合能力较铁皮石斛弱。环草石斛试管苗的ETRmax呈下降趋势，说明在设定的培养条件下，其光合能力逐渐降低，而铁皮石斛试管苗的光合速率相对较稳定。不同种类石斛试管苗的气孔特性不同，因而光合速率也不同，这种差异可能也是导致环草石斛和铁皮石斛试长势存在差异的主要原因之一。ETR光响应曲线研究结果显示，不同发育时期石斛试管苗的光饱和点均在150 μmol/(m2·s)以上，而该试验所设定的最高光强仅为54 μmol/(m2·s)，因此在这方面还有待于作更全面深入的研究。