用于抑制SPR晶片表面非特异性结合的亲水性聚合物PHMP涂层的制备及表征

生物传感器是检测领域中一种重要的工具，它通过将生物识别元件和信号转换元件结合，实现对目标物成分的分析和监测，具有选择性好、无需试剂、操作简便、可重复使用及在线分析等优点[1]。近年来，各种基于不同原理的生物传感器被开发并用于医疗诊断、环境监测、食品检验等领域[2]，其中，一种利用免疫原理和表面等离子体共振（Surface Plasmon Resonance，SPR）相结合的技术受到了广泛的关注[3-5]。SPR利用了金属薄膜的表面等离子体共振效应，通过在晶片表面修饰生物分子识别膜，当待测样品流过芯片表面时，样品中的目标分子与生物分子识别膜的相互作用会引起金膜表面折射率变化，从而引起SPR角的变化，通过检测SPR角度变化，可以获得被分析物的浓度、亲和力、动力学常数和特异性等信息[6]。

基于抗体-抗原免疫反应的SPR晶片由于其较高的特异性和测量精度，具有良好的发展前景[7-9]。然而，SPR的应用依赖于晶片在高度复杂介质中的稳定性。例如，在附着抗体的表面上，金表面极易与血清蛋白发生非特异性结合,这种分子与表面的非特异性结合会影响目标分析物的信号[10]。因此，为了获得相对稳定和灵敏的测量结果，一些研究使用生物相容性聚合物对SPR晶片进行修饰，并证明通过生物相容性的修饰可减少SPR用于尿液、血液和血清中目标分子分析的非特异性结合[11-14]。

本研究使用了一种2-甲基丙烯酸羟乙酯、2-甲基丙烯酰氧乙基氧羰基对苯叠氮、多乙二醇甲基丙烯酸酯基对硝基苯酚甲酯共聚物（PHMP）作为SPR传感器涂层，该涂层在为抗体提供结合位点的同时减少了SPR晶片表面的非特异性结合，从而有助于SPR晶片在复杂生物质环境中实现较高灵敏度和精确度的分析。

1 材料与方法

1.1 材料

2-甲基丙烯酸羟乙酯（HEMA）、氯化亚砜、对叠氮苯甲酸、对硝基苯酚氯甲酯（NPC）、3-巯基丙酸乙酯，购自Sigma Aldrich；多乙二醇甲基丙烯酸酯，购自NOF有限公司。三乙胺（TEA）为89℃蒸馏精制后使用，其余溶剂试剂均为分析纯且无需进一步纯化。

1.2 2-甲基丙烯酰氧乙基氧羰基对苯叠氮（MPAz）的合成

将亚硫酰氯（37 g，0.10 mol）和对叠氮苯甲酸（12 g，0.080 mol）加入到苯（74 g，0.90 mol）中并在80℃加热4 h。过滤后，减压蒸馏除去苯和亚硫酰氯，将得到的对叠氮苯甲酰氯溶解在石油醚（60 g）中并过滤除去未反应的对叠氮苯甲酸。减压蒸馏除去石油醚以获得对叠氮苯甲酰氯。将对叠氮苯甲酰氯（9.0 g，0.050 mol）、氯仿（90 mL）加入300 mL三颈圆底烧瓶，在0℃下逐滴加入HEMA（0.050 mol）和TEA（0.050 mol）并在室温下搅拌反应12 h。使用含有氯化氢（0.050 mol）的水洗除去未反应的HEMA和TEA，含有MPAz的氯仿溶液经无水硫酸镁脱水后过滤，并减压蒸馏除去氯仿，得到黄色油状液体MPAz。

1.3 多乙二醇甲基丙烯酸酯基对硝基苯酚甲酯（PEMN）单体的合成

将NPC（20.2 g，0.10 mol）、氯仿（180 mL）加入500 mL三颈圆底烧瓶，在0℃下逐滴加入多乙二醇甲基丙烯酸酯（乙二醇聚合度为10，65.1 g，0.10 mol）和TEA（0.10 mol）并在室温下搅拌反应12 h，使用含有氯化氢（0.050 mol）的水洗除去未反应的多乙二醇甲基丙烯酸酯和TEA，使用乙醚沉淀得到黄色油状液体PEMN。

1.4 聚合物PHMP的合成

聚合物PHMP可通过常规的自由基聚合反应获得，聚合物的化学结构见图1。将HEMA、MPAz、PEMN单体溶解在乙醇中，加入引发剂AIBN，聚合反应在65 ℃进行12 h。聚合物通过加入到过量的乙醚和氯仿（3/1体积）中沉淀纯化。聚合物的化学结构通过1HNMR确定，聚合物的分子量通过凝胶渗透色谱法（GPC）测量，含有10 mmol/L溴化锂的甲醇和水的混合物（7/3体积）用作洗脱剂。

图1 PHMP的化学结构

1.5 光诱导枝接在金表面制备聚合物涂层

本研究使用镀金二氧化硅衬底（在二氧化硅表面溅射10 nm铬和100 nm金）用于聚合物涂层的表征。使用氧等离子体处理10min清洁表面，将基底浸入EMP的乙醇溶液（20 mmol/L）中8 h，使用乙醇和去离子水冲洗除去过量的EMP。将含有0.5%质量百分比的PHMP乙醇溶液滴加在基底表面，通过1 min的紫外线照射（254 nm，80 mW/cm2）制备聚合物涂层。用乙醇和去离子水交替冲除去未枝接的聚合物。

1.6 在聚合物涂层表面结合抗体

将抗促甲状腺激素（anti-TSH）鼠免疫球蛋白（IgG）浓度为20 μg/mL的PBS（pH=8.4，浓度为0.1 mol/L）滴加在聚合物涂层修饰的表面，在25 ℃保持10 h后PBS（pH=7.0，浓度为0.1 mol/L）和去离子水交替冲洗表面。表面元素组成分析通过X光电子能谱（XPS，聚焦单色镁KαX光源）进行。

1.7 SPR晶片的制备及表征

按1.5、1.6的步骤处理镀金SPR晶片并结合抗体。为了验证聚合物涂层对非特异性结合的抑制作用，分别使用未经处理和处理后的SPR晶片，以0.5 mL/min的流速注入含10 mg/mL的牛血清蛋白（BSA）溶液，监控SPR角度的变化。特异性结合的验证则使用修饰过的晶片，将含有500 ng/mL TSH的牛血清蛋白（BSA，10 mg/mL）溶液以0.5 mL/min的流速注入，并以不含TSH的BSA溶液作为对照。

2 结果与讨论

2.1 聚合物合成

聚合物PHMP可通过自由基聚合合成，合成结果总结在表1中。聚合物的化学结构由1HNMR谱图中化学位移为3.7 ppm（与羟基相邻的亚甲基）、7.0 ppm（与叠氮相邻的苯环）、8.9 ppm（与硝基相邻的苯环）的峰确定。

表1 PHMP的合成结果

注：Mw-重均分子量；Mn-数均分子量。

2.2 XPS表征

如图2所示，晶片表面的元素组成信息由XPS提供。N1s的峰在未经处理的晶片表面不存在，而在聚合物修饰后的表面则在400.1eV和406.7eV处有两个峰，分别来自于叠氮反应后生成的酰胺和PEMN中的硝基。而在搭载有抗体的晶片表面，N1s的峰出现在401.1eV处，来自于抗体中的酰胺。这一结果证实了可通过光反应枝接和活性酯的胺解依次将聚合物和抗体结合在金衬底表面。

图2 晶片表面的XPS图谱（N1s）

2.3 聚合物涂层对非特异性结合的抑制作用

为了在复杂生物质环境中使用SPR传感器，必须减少来自血液或体液中生物分子非特异性结合的信号。未经处理的SPR传感器在复杂生物质环境中很容易由于生物分子的非特异性结合而失效。在本实验中，BSA溶液流过未经处理的SPR传感器时，非特异性结合引起的SPR角度变化约为0.217°（图3A），该信号为抗体-抗原结合信号的10～20倍，致使目标分子的信号难以从待测物中区分。而BSA溶液流过表面修饰过的SPR传感器时，非特异性结合引起的SPR角度变化约为0.035°（图3B），证明聚合物涂层有效减少了来自BSA的非特异性结合。

图3 BSA注入SPR晶片引起的SPR角变化

注：A：无涂层；B：有涂层

2.4 抗体与TSH的特异性结合

当TSH和BSA混合溶液注入SPR晶片时，TSH与抗体的特异性结合和BSA的非特异性结合共同引起SPR角的变化。在扣减非特异性结合的信号后，得到的TSH信号如图4所示，可见500 ng/mL的TSH引起的SPR角变化为0.0147°，SPR晶片的性能因数（Performance Factor，PF）可以用特异性结合角度变化与非特异性结合角度变化的比值来衡量，在此实验中，经过涂层修饰的SPR晶片的性能因数为0.42。

图4 TSH+BSA注入有涂层的SPR晶片引起的SPR角变化（已扣减非特异结合的信号）

3 结论

本研究合成了一种亲水性聚合物PHMP并将其通过光反应枝接的方法用于SPR晶片表面修饰。实验证明经过修饰的镀金SPR晶片能够减少蛋白质与晶片表面的非特异性结合。本研究进一步将修饰后的SPR晶片搭载TSH抗体并用于模拟体液中TSH的检测，经实测，该方法得到的SPR晶片性能因数为0.42。