摘 要 构建了适用于纳升级到微升级流量的毛细管分离体系的微流蒸发光散射检测器(μELSD)，实现了其与毛细管液相色谱(cLC)的联用。对雾化器孔径和雾化毛细管内径、蒸发管内径和长度、光散射池尺寸、雾化毛细管位置和辅助载气流量等参数进行了优化。在最优条件下，微流蒸发光散射检测器检出限为直接进样葡萄糖1 ng(S/N＞10)，线性范围0.01～1.0μg，重复性好，峰面积RSD(n=6)为0.4%，峰高RSD(n=6)为0.3%。本检测器已成功应用cLC-μELSD平台，使用C18毛细管色谱柱(内径250μm)，0.1%甲酸铵溶液(pH 4.5)-甲醇(60:40，V/V)为流动相，分离检测了3种常用甜味剂，表明本研究构建的系统可以应用于实际分离检测中，具有分析时间快、溶剂消耗量少、样品需求量小的优点。
关键词 蒸发光散射检测器;毛细管液相色谱;微型化;甜味剂
1 引言
近年来，毛细管液相色谱(Capillary LC)分离技术迅速发展。在毛细管液相色谱分离过程中，流动相和样品的使用量少，环境污染小，渗透性好，理论柱效高，易与其它检测方法在线联用等优点。因此，在生化分析、手性分离、神经科学、蛋白质和多肽研究、医药分析等领域广泛应用。目前，用于毛细管液相色谱的检测手段有紫外吸收法、激光诱导荧光法、电化学检测法及质谱检测法等，其中紫外吸收法、激光诱导荧光法和电化学检测法均为特征性检测手段，只有具有紫外、荧光官能团或电活性物质才可以被检测，应用受到很大限制;质谱虽然可以作为通用型检测器，但仪器本身的使用和维护成本很高，不便于普及。
蒸发光散射检测器(Evaporative light-scattering detector，ELSD)，是自20世纪90年代开始得到广泛应用的通用型高效液相色谱质量检测器［1～4］，其原理是基于将色谱柱洗脱液雾化形成气溶胶，然后在加热的漂移管中将溶剂蒸发，余下的不挥发性溶质颗粒在光散射检测池中得到检测。相比目前色谱检测中使用最多的紫外检测器，ELSD具有更高的通用性，不受物质本身结构的限制，适用于绝大多数不挥发和半挥发物质的分析检测，尤其在天然产物(包括中草药)、药物及食品分析(氨基酸、糖类、酯类)等领域更具优势［5～9］。通过对ELSD的研究发现，这种类型的检测器对峰展宽的贡献很小［2～4］，故非常适合于微分离技术报道，所以ELSD的微型化也引起了国际仪器学家的关注。目前仅有数篇关于对商品化ELSD进行部分改造的微型化，改造后的ELSD与微径液相色谱联用［10～14］进行分离检测的报道，尚未见整体微型化ELSD的研究报道。
本研究分别对ELSD的雾化、蒸发和检测部分进行了整体微型化设计，构建了微流蒸发光散射检测器，实现其与毛细管液相色谱的联用，系统考察了检测器性能参数，并将其应用于葡萄糖及3种常用甜味剂的分离检测。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
TrisepTM-2100三用加压毛细管电色谱仪(美国Unimicro公司);配有Trisep-2003色谱工作站(上海通微分析技术有限公司);毛细管液相色谱柱(EP-250-15-5-C18，苏州环球色谱有限公司);高纯氮气(上海纵远化工有限公司);甲醇(色谱纯，国药集团化学试剂有限公司);乙腈(色谱纯，美国TEDIA公司);葡萄糖(分析纯，国药集团化学试剂有限公司);纯净水(杭州娃哈哈集团)。阿斯巴甜(Supelco公司，批号:LB77422，纯度≥99.0%);甜蜜素(阿拉丁试剂有限公司，批号:33800，纯度≥99.0%);三氯蔗糖(德国Dr.Ehrenstorfer公司，批号:80722，纯度≥98.5%);甲酸、氨水(分析纯，上海润捷化学试剂有限公司)。
葡萄糖标准溶液的配制:称取适量葡萄糖，用纯净水溶解，配制成10 g/L储备液，工作溶液用纯净水稀释至所需浓度。
甜味剂标准溶液配制:分别取适量甜蜜素、三氯蔗糖和阿斯巴甜对照品，以纯净水配制成一定浓度的单标储备溶液，冰箱保存(阿斯巴甜-4℃，其余4℃保存)，有效期为1个月，使用时用流动相稀释成所需浓度。
甲酸缓冲溶液:取1 L水，加入甲酸至浓度为0.1%(V/V)，再加入氨水调节溶液pH值，配成pH 4.5的含有0.1%(V/V)的甲酸缓冲溶液，现配现用。
2.2 微流蒸发光散射检测器结构
微流蒸发光散射检测器由雾化器、蒸发漂移管、光散射池、信号放大和记录系统组成，包括依次同心连接的雾化器、蒸发管以及光散射池，雾化器中心雾化毛细管，侧面载气入口;蒸发管置于保温套筒内，并且蒸发管的外侧分布有若干通过导线相连分布有加热电阻，光散射池侧面分别为光阱、激光光源和光电倍增管。核心部分的结构示意图见图1。
2.3 微流蒸发光散射检测器工作原理
主要包括3个过程:雾化器与毛细管色谱柱出口通过雾化毛细管连接，经色谱柱分离的组分随流动相进入雾化器中，与载气混合，喷成均匀的雾滴(雾化过程);雾滴随载气高速通过可以控制温度的蒸发漂移管，流动相被蒸发，溶质形成极细的雾状颗粒(蒸发过程);在光散射池中，溶质颗粒散射从激光光源发出的光，散射光经光电倍增管放大后变成电信号输出(光散射和检测过程)。
2.4 甜味剂的色谱分离检测条件
色谱柱分离条件:EP-250-15-5-C18(250μm内径，15 cm长，填充5μm C18固定相);流动相:甲醇-0.1%甲酸铵溶液(4∶6，V/V);流速:3μL/min;样品:2 g/L甜蜜素，三氯蔗糖，阿斯巴甜3种甜味剂混合标准品;进样体积:10 nL。
检测条件:蒸发温度:120℃;雾化载气:氮气;载气流量:2.0 L/min;雾化压力:380 kPa。
图1 微流蒸发光散射检测器结构示意图
Fig.1 Schematic diagram of micro-evaporative light scattering detector(μ-ELSD)
1.雾化器(Nebulizer);2.载气入口(Nebulization gas inlet);3.蒸发漂移管(Drift tube);4.加热模块(Heating unit);5.保温套筒(Insulation sleeve);6.鞘流套(Sheath assembly);7.辅助载气入口(Accessorial gas inlet);8.光阱(Light trap);9.光电倍增管(Photomultiplier); 10.光散射池(Detection cell); 11.激光光源(Laser);12.雾化毛细管(Capillary)。
3 结果与讨论
3.1 雾化器尺寸的选择
文献［11］报道，只有在雾化载气线性流速可以达到超音速(＞332 m/s)时，得到的雾化颗粒大小和均匀度才能保证ELSD的最佳灵敏度和稳定性。雾化器包括雾化喷嘴和雾化毛细管两部分，两部分尺寸的配合(即雾化毛细管外径与雾化喷嘴内径之间的间隙d)对雾化载气速度具有重要影响。同时，雾化毛细管内径对雾化颗粒的形成也起到关键作用。因此，本实验根据分析型ELSD中间隙d值作为参考，选择加工了内径为410和440μm雾化喷嘴，匹配不同内径(10，25，50，75，100和150μm)、外径为360μm的雾化毛细管，以1 g/L葡萄糖溶液直接进样，考察信噪比。结果表明，410μm雾化喷嘴与360μm外径雾化毛细管配合使用效果更好。实际使用中，内径为10和25μm的雾化毛细管很容易堵塞，其它内径毛细管均可重复使用，并且信噪比随着雾化毛细管内径的增大而减小(见图2)。所以本研究最终选择雾化器尺寸为410μm内径雾化喷嘴和50μm I. D.×360μm O.D.雾化毛细管配合。
3.2 雾化毛细管位置的选择
雾化毛细管顶端相对雾化喷嘴的位置会影响检测信号。考察了与雾化喷嘴平齐、缩进，伸出3种状态的影响(图3)。James等［11］对雾化毛细管与雾化器喷嘴的相对位置的研究表明，随流动相的不同，相对位置有明显的差异;当以水为流动相时，是以平齐状态的信噪比最高;以50%(V/V)甲醇为流动相时，则以伸出距离在0.4～1.4 cm的位置为最佳。
实验表明，末端伸出喷嘴一段位置时，噪声增大，峰形分散，很难得到可积分的峰型，所以排除这种情况;缩进与平齐状态的峰形未有明显差别。从图4可见，缩进状态的信噪比明显优于平齐状态，对于喷针的位置可以考虑选用缩进状态，但是缩进状态的问题在于缩进距离很难精确控制和测量，若更换雾化毛细管则无法达到很好的重现性。所以本研究在优化其它仪器硬件条件时，均采用雾化毛细管顶端为平齐位置，以保证其结果的可靠性。
图2 雾化毛细管内径对信噪比的影响
Fig.2 Effect of capillary inner diameter on signal-tonoise ratio
图3 雾化毛细管顶端位置示意图
Fig.3 Examples of three effluent capillary tip positions
3.3 蒸发漂移管尺寸的选择
通过实验确定蒸发漂移管最佳长度及内径，在保证溶剂充分蒸发的情况下，尽量减小蒸发管体积，降低样品扩散。本实验以葡萄糖为样品，分别测试了长度为10，15和20 cm，内径为2.6，3.6和4.6 mm的蒸发管。结果表明，在相同条件下，15 cm长蒸发管信噪比最大。这可能是由于当蒸发管过长时，样品将会产生扩散，并且溶质也有可能部分蒸发;但蒸发管太短，流动相又无法达到完全蒸发的效果，噪声变大，信噪比降低。由图5可见，信噪比随着蒸发管内径增大而增强。所以本研究最终选择内径4.6mm，长15 cm的蒸发漂移管。
图4 不同位置喷针的信噪比随载气流速的变化
Fig.4 Signal-to-noise ratio as a function of nebulization gas flow with different position of effluent capillary
图5 不同内径漂移管的长度对信噪比的影响
Fig.5 Effect of drift tube length on signal-to-noise ratio at different tube inner diameters
3.4 光散射池尺寸的选择
对两种尺寸(60 mm×33 mm i.d.和45 mm×15 mm i.d)的光散射池进行考察。在上述实验确定的雾化和蒸发的最佳条件下，对比两种光散射池的信噪比和峰型，结果见表1。从表1可见，使用45 mm×15 mm i.d.光散射池，虽然峰形得到改善，但信噪比相比60 mm×33 mm i.d.光散射池降低40倍。为提高检测灵敏度，本研究选择大的光散射池(60 mm×33 mm i.d.)进行实验。
3.5 辅助载气流量的影响
本研究设计了鞘流结构提供辅助载气，在溶质颗粒进入光散射池时起到包裹作用，期望可以提高检测灵敏度，并对光散射池起到一定的清洁作用。实验中，对辅助载气流量进行了考察，结果见图6，随着辅助载气流量的增大，信噪比随之降低，峰型有所改善，但不明显。所以本实验最终确定辅助载气流量为0～0.5 L/min。
表1 不同检测池对信号的影响
Table 1 Signal as a function of detection cell
3.6 微流蒸发光散射检测器的评价
检出限、线性和重复性是衡量检测器性能的重要性能指标。本研究以葡萄糖为样品，对上述性能指标进行测试。经测试，直接进样1 ng葡萄糖的信噪比大于10(检出限)。本研究选择100 ng葡萄糖样品测试此联用系统的重复性，连续进样6次，峰面积的RSD为0.4%，峰高的RSD为0.3%。分别进样0.01，0.05，0.1，0.5和1μg葡萄糖，以进样质量(ng)的对数X为横坐标，以峰面积的对数Y为纵坐标，进行线性回归，Y=0.677X+3.2451，R2=0.9906。μELSD的线性范围约为2个数量级。
3.7 应用μELSD检测甜味剂
人工合成甜味剂种类繁多，物理化学性质以及光谱性质各异，如阿斯巴甜在低波长有紫外吸收，甜蜜素和三氯蔗糖没有紫外吸收。蒸发光散射检测器(ELSD)作为一种通用的检测器，可以不受物质本身结构的限制，适用于检测任何挥发性弱于流动相的物质。本实验在2.4节所述的分离检测条件下，应用毛细管液相色谱-微流蒸发光散射检测器(cLC-μELSD)联用技术分离了甜蜜素、三氯蔗糖和阿斯巴甜3种甜味剂标准品，均达到基线分离，得到了理想的分离效果(图7)。
图6 辅助载气流量对信噪比和拖尾因子的影响
Fig.6 Signal-to-noise ratio and noise as a function of sheath flow
图7 3种甜味剂标准溶液的cLC-μELSD谱图
Fig.7 cLC-μELSD chromatograms of three sweeteners
1.甜蜜素(Sodium cyclamate);2.三氯蔗糖(Sucralose);3.阿斯巴甜(Aspartame)。
实验表明，研制的微流蒸发光散射检测器，适用于毛细管分离体系的分析检测。在实际分离检测中，具有通用性好、分离效率高、溶剂消耗量少、样品需求量小等优点。
