摘 要：研制了一种适合普通厚度盖片的分析芯片的差示式非接触电导检测器。在芯片上制作分离通道和参比通道，并在独立的电极板上对应于两通道末端位置设置两对电极，分析芯片置于电极板上。信号发生器产生的高频信号分成两路，分别加至分离通道和参比通道对应的激发电极，两通道对应的接收电极的微弱信号经差示放大和整流。当组分经过分离通道电极间区域时，电导率与参比通道出现差异，获得检测信号。实验考察了激发频率、激发电压、电极间距等对检测性能的影响。在优化检测条件下，即检测频率100 kHz、检测电压10 V(Vp-p)、电极间距0.9 mm时，对K+的检出限达12 μmol·L-1，相对标准偏差为1.1%，并成功用于Na+、K+离子的分离检测。该检测器适用于容易制作的普通厚度盖片的分析芯片的检测，且芯片与电极板相互独立，使用方便。
关键词：非接触电导检测；差示式检测；微流控芯片
微流控芯片因分析速度快、分离效能高、溶液消耗少、样品用量小、环境污染小、仪器装置简单等优点，已应用于化学、生命科学、药学等领域。其中非接触电导检测是研究较多、应用较广的检测方式之一，近年来在非接触电导检测装置中芯片及电极设计中主要有以下几种方式：①四电极的非接触电导检测器[1-2]，在电极表面镀上一层硅碳作绝缘材料；②在芯片基片上的分离通道两旁刻蚀电极槽，将电极放在电极槽中[3-7]，然后与芯片盖片键合，基片材料即形成了电极与分离通道间的绝缘材料，需要采用高精密的刻蚀技术；③在芯片的盖片(与基片键合的反面)上刻蚀电极通道[8-11]；④采用印刷技术将电极镀在芯片盖片的背面，检测电极和分离芯片相互独立，这种检测器装置简单，方便更换芯片并可调节有效分离通道长度[12]，已成功地应用于药物分析[13-14]。目前此检测器采用的芯片有两种，一种是具有较薄盖片的玻璃芯片，此种芯片的制作成本较高；另一种是具有较薄盖片的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)芯片，此种芯片的制作成本较低，但使用时对高压、缓冲溶液有一定的限制。为避免上述不足，本实验采用普通厚度盖片的玻璃芯片作分离分析芯片，尝试通过改变检测器条件，提高检测器的频率和电压来提高装置的灵敏度。实验初步优化了电极间距、电极长度、检测器的激发电压、激发频率等对检测灵敏度的影响，实现了对一些无机离子的检测和分离。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
微流控芯片专用高压源(自制)；YDS996A函数信号发生器(仪征市培明电子仪器厂)；电导检测装置(自制)；色谱工作站(中山大学药学院分析仪器研究所)；SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵(巩义市英峪予华仪器厂)；JKG-2A型紫外光刻机(上海学泽光学机械有限公司)；铬版(长沙韶光铬版有限公司)。
2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES，上海生工生物工程有限公司)；组氨酸(His，上海润捷化学试剂有限公司)；三羟甲基氨基甲烷(Tris，保证纯，香港分装)；NaCl、KCl、硝酸铈铵、冰乙酸、氟化铵、氢氟酸、硝酸、三氧化铁、双氧水(分析纯，广州化学试剂厂)。实验用水为双蒸水，所有溶液使用前经超声脱气10 min，并用0.22 μm孔径的滤膜过滤。
1.2 芯片制作
芯片的材料为玻璃。用CorelDraw绘图软件设计微通道图案，包括分离通道和参比通道，两通道尺寸严格一致，在分离通道上设有十字形进样通道，通过激光照排制作成分辨率为3 000 dpi的胶片(掩膜)，在紫外光刻机上曝光120 s，显影，铬版置于除铬液(20 g硝酸铈铵和3 mL冰乙酸加水至100 mL)中浸泡2 min后除铬层。去铬后的铬版置于刻蚀液(取氟化铵 5.5 g，加水适量使溶解，加氢氟酸13.3 mL和硝酸10.5 mL，加水至300 mL)中刻蚀20 min，水洗干净，在各通道末端各打直径2 mm的小孔，得芯片基片。另取厚度1.3 mm的普通载玻片作盖片，与基片高温键合。所得芯片的通道上宽为70 μm，深50 μm，分离通道长70 mm，有效分离长度为60 mm，盖片厚度为1.3 mm，结构如图1A所示。
图1 芯片(A)和电极板(B)的结构示意图
Fig.1 Structure diagram of chip(A) and printed circuit board for electrodes(B)
1.3 非接触电导检测器制作
本检测器的两对非接触电极制作在与芯片独立的电极板上，电极形状如图1B所示。将此图案设计在印刷丝网上，用普通油墨将电极形状印在敷铜板上，待干后将敷铜板浸入 20%三氯化铁- 10% 双氧水混合溶液中，1 h 后取出用水清洗，再用甲苯或氯仿将油墨洗去。
使用本研究组前期研制的电磁感应检测器[15]的差示检测电路(图 1A)，该电路连接的两个电感器换成连接上述电极板的两组非接触电极(a-a′和b-b′)。将芯片置于电极板上，两组非接触电极的位置分别对应于芯片上的分离通道和参比通道。
1.4 实验过程
芯片在每次使用前，分离通道和参比通道均依次用0.1 mmol·L-1 NaOH、水和缓冲溶液分别冲洗10、5、10 min。再将分离通道和参比通道充满相同的缓冲溶液。以300 V的电压(根据需要调节进样时间)进样，然后切换分离电压，进行分离检测。检测器的输出信号经数据工作站采集到微机中进行图形显示和数据文件储存，然后进行数据处理。每天实验完后，芯片通道用乙醇和水各冲洗10 min，并用水充满芯片通道。
2 结果与讨论
本检测器工作原理为：信号发生器产生的高频信号分成两路，分别加至分离通道和参比通道对应的激发电极，两通道对应的接收电极的微弱信号经差示放大和整流。当组分经过分离通道电极间区域时，电导率与参比通道出现差异，从而获得检测信号。因此，本实验分别考察了激发频率、激发电压、电极间距等对检测性能的影响。
2.1 检测器性能
由于本实验采用较厚的玻璃盖片做成分析芯片，因而需用较高的检测频率或检测电压才能接收到一定的检测信号。实验考察了激发频率(30～200 kHz)、激发电压(0～20 V (Vp-p))对输出电压的影响。图2A结果表明，当固定高压信号源为10 V(Vp-p)时，在30 ～130 kHz范围内，其激发频率越高，输出信号越强；但当激发频率大于130 kHz时，输出信号随频率的增加而减小。固定高频信号源为100 kHz，进一步考察了激发电压的影响(图2B)。结果显示，在激发电压为0～20 V (Vp-p)范围内，输出信号与激发电压成正比。由于商品化函数信号发生器最大输出为20 V(Vp-p)，更高的激发电压未能考察。
图2 信号输出与激发频率(A)、激发电压(B)的关系
Fig.2 Relationships between output signal and excitation frequency(A) and excitation voltage(B)
2.2 电极间距-激发频率的优化
考察了不同激发频率(30～200 kHz)下，不同电极间距对K+离子检测信号的影响。图3A显示：在20～130 kHz范围内，峰高值随激发频率增加而增大，但当频率大于130 kHz时，除电极间距0.7 mm外，其余间距的峰高值均随激发频率的增加而减少；峰高值则随电极间距的增加而减少，当电极间距在0.9 mm时峰高值最大。图3B的结果进一步显示，电极间距0.9 mm、激发频率100 kHz时，所获得的信噪比(S/N)值最大，表明本实验的最佳检测频率为100 kHz。
图3 不同电极间距获得的峰高(A)和信噪比(B)与激发频率的关系
Fig.3 Peak height(A)and S/N ratio(B) in various excitation frequency for different distances between two electrodes excitation voltage:10.0 V(Vp-p); running buffer:15 μmol·L-1 MES+His; sample:10 μmol·L-1 KCl;separation voltage:3.0 kV; electrode length:6 mm; injection time:20 s
2.3 电极间距-激发电压的优化
考察了不同检测电压下，电极间距对K+离子检测信号的影响。如图4A所示：在0～15 V(Vp-p)范围内，峰高随检测电压增高而增大，但当激发电压大于15 V(Vp-p)时，峰高随激发电压增大而明显减少，其中检测间距在0.9 mm时峰高值最大；如图4B所示，当电极间距在0.9 mm、激发电压在10.0 V(Vp-p)时，S/N值最大，表明本实验的最佳激发电压为10 V(Vp-p)。
图4 不同电极间距获得的峰高(A)和信噪比(B)与激发电压的关系
Fig.4 Peak height(A) and S/N ratio(B) in various excitation voltage for different distances between two electrodes excitation frequency:100 kHz; other conditions were the same as those in Fig.3
图5 0.1 mmol·L-1 KCl-0.1 mmol·L-1NaCl混合物的分离色谱图
Fig.5 Chromatogram of 0.1 mmol·L-1 KCl -0.1 mmol·L-1 NaCl mixture excitation voltage:10 Vp-p,excitation frequency:100 kHz,electrode length:6 mm,distances between electrodes:0.9 mm,other conditions were the same as those in Fig.3
2.4 电极长度的优化
在检测频率100 kHz、激发电压10.0 V(Vp-p)、电极间距0.9 mm的条件下，考察了不同电极长度对K+离子检测信号的影响。当电极长度分别为3、6、9 mm时，测得峰高值分别为117.1、125.6、119.0 mV，信噪比分别为45.7、51.2、49.1。结果表明电极长度为6 mm时，所获得的峰高值和信噪比最大，即电极的最佳长度为6 mm。
2.5 性能测试与样品分析
在上述优化检测条件下，成功分离检测了0.1 mmol·L-1 的KCl和NaCl混合物，所得色谱如图5所示。根据信噪比(S/N=3)计算得到K+离子的检出限为12 μmol·L-1。6次进样结果算得平均标准偏差(RSD)为1.1%。
3 结 论
本文设计的非接触电导检测器，适用于普通厚度盖片的分析芯片的检测。从检测原理上看，盖片越薄的分析芯片，越容易进行非接触电导检测。但薄盖片的分析芯片，其加工难度大、使用过程容易损坏、易被分离高压击穿。而普通厚度盖片的分析芯片，制作简单，但检测信号很弱。本研究采用双通道差示检测的方式，解决了这一问题，虽然灵敏度仍略低，但具有较强的实用性。另外，由于芯片与电极板相互独立，使用非常方便。
