一种基于异硫氰酸荧光素的pH 纳米传感器制备

1 引 言

氢离子对生物体的生命活动起着重要的调控作用，一些生命现象的发生常伴随着氢离子浓度的变化，因此在细胞水平等微环境中实时检测pH变化具有重要的意义[1-2]。传统的宏观pH电化学和光纤传感器无法精确监测细胞等微环境的pH变化，发展分子结构或纳米量级的pH传感器可有效实现微环境检测[3-5]。在常用的pH检测方法中，基于荧光信号变化的检测方法具有高的灵敏度、良好的选择性和非侵入性等优点，受到研究者的广泛关注[6-8]。异硫氰酸荧光素(FITC)是一种常见的pH敏感荧光染料分子，对pH值的变化能够迅速响应，且具有高的灵敏度[9-11]。但是荧光分子探针存在光漂白及细胞毒副作用等缺陷，影响检测结果的准确性。相比于单个荧光染料分子，通过纳米颗粒负载荧光染料可提高探针的稳定性和发光强度[12-14]。在荧光生物分析中，荧光纳米颗粒正逐渐代替荧光探针分子，在生物标记、成像示踪和传感检测中发挥着重要的作用[15-17]。

本文利用共沉淀法制备了封装pH敏感染料FITC的纳米颗粒(FITC-NPs)，在纳米颗粒中，选择聚苯乙烯(PS)和十二烷基三甲氧基硅烷(DTS)为基质材料，FITC被封装于颗粒内部，颗粒外表面则包覆多聚赖氨酸壳层(PLL)。异硫氰酸荧光素的荧光强度随pH增加而逐渐增强，基于纳米传感器的荧光信号变化能够快速地对pH值的变化作出响应，多聚赖氨酸的表面修饰可提高纳米传感器的生物相容性和细胞吞噬效率，将促进纳米传感器在细胞内pH值检测方面的应用。

2 实 验

2.1 试剂与仪器

试剂：异硫氰酸荧光素(FITC)、多聚赖氨酸(PLL)和聚苯乙烯(PS)购自Sigma-Aldrich，十二烷基三甲氧基硅烷(DTS)购于玛雅试剂，四氢呋喃(THF)购自国药集团化学试剂有限公司，实验过程中均使用去离子水。

荧光pH纳米传感器的激发和发射光谱由日立公司生产的F-4600荧光分光光度计测得；纳米颗粒的形貌由日立JEM 1400EX透射电子显微镜进行表征；利用马尔文Nano ZS90粒度仪分析纳米颗粒的动态光散射粒径(DLS)；利用日本分光株式会社V-550分光光度计测试紫外-可见吸收光谱；通过日本尼康公司生产的A1Rsi共聚焦激光扫描显微镜进行细胞荧光成像。

2.2 样品的制备方法与步骤

荧光pH纳米传感器采用共沉淀法进行制备。 首先，配置FITC(2×10-4)、PS(2×10-3)和DTS(2×10-3)的四氢呋喃(THF)溶液，待其溶解后，按照质量比为10∶45∶45进行混合，通过添加THF使最终样品浓度为5×10-4；然后，在超声振荡的条件下，将混合溶液注入到含有0.02 mg/mL PLL的去离子水溶液(pH＝9)中，随后避光静置2 h后，再于去离子水中透析12 h以去除有机溶剂，即可得到荧光pH纳米传感颗粒。

3 结果与讨论

3.1 荧光pH纳米传感器的制备与表征

利用共沉淀法制备荧光pH纳米传感器[18-19]。将异硫氰酸荧光素(FITC)、十二烷基三甲氧基硅烷(DTS)和聚苯乙烯(PS)的混合溶液在超声环境中注入到含有多聚赖氨酸(PLL)的水溶液中，疏水性物质缩聚形成纳米颗粒。纳米颗粒的结构如图1(a)所示，FITC随机分散于纳米颗粒核心部位，硅氧烷水解缩聚在纳米颗粒表面形成二氧化硅壳层，吸附带正电的多聚赖氨酸分子形成PLL包覆的纳米颗粒(FITC-NPs)。纳米颗粒的形貌通过透射电子显微镜(TEM)进行表征，如图1(b)所示，颗粒呈球状，具有良好的分散性。通过分析该纳米颗粒溶液的动态光散射粒径分布(图1(c))，发现纳米颗粒的水合粒径平均值在150 nm左右。为了分析荧光pH纳米传感器的发光特性，我们对其进行吸收和发射光谱表征。从图2中可以看出，FITC的吸收峰在495 nm左右，发射峰位于520 nm左右，对于 FITC-NPs，其在480 nm光激发下产生位于520 nm处对应于FITC的发射峰(图3(a))，证明FITC成功掺杂于纳米颗粒中，形成荧光pH纳米传感器。

图1 (a)pH纳米传感器的结构示意图；(b)纳米传感器的TEM图像；(c)纳米传感器的动态光散射粒径分布。
Fig.1 (a)Schematic illustration of FITC-NPs.(b)TEM images of pH nanosensors.(c)Hydrodynamic diameter of nanosensors measured by DLS.

图2 FITC的吸收和发射光谱
Fig.2 Absorption and emission spectra of FITC dissolved in THF aqueous

3.2 纳米传感器的pH响应特性

为了研究纳米传感器的pH响应特性，我们分析了不同pH条件下纳米传感器发光强度的变化。如图3(a)所示，随着pH值的升高，纳米传感器在520 nm处的发射峰强度也逐渐增强，这是由于FITC对pH具有高的敏感性。为进一步分析纳米传感器的pH敏感性，利用 FITC-NPs在520 nm处荧光发射强度与不同pH的Sigmoidal拟合曲线(图3(b))，计算得到 pKa值为6.07[20]。当pH值由3增加到5时，纳米传感器荧光强度增长较为缓慢；pH值由5上升到7时，荧光强度迅速增加；而pH值大于7以后，荧光强度增长趋于缓慢。当pH从3变到9时，荧光强度增大约38倍，表明该纳米传感器对pH具有良好的灵敏度。

图3 (a)纳米传感器在不同pH环境中的发射光谱；(b)荧光强度在不同pH环境中的响应拟合曲线。
Fig.3 (a)Emission spectra of nanosensors at various pH concentrations.(b)Sigmoidal fitting plot of fluorescence intensity.The experiment data were calculated from Fig.3(a).

荧光pH纳米传感器的光稳定性对检测精确度具有重要影响，为分析FITC-NPs的光稳定性，本文对比研究FITC溶于THF溶液中和掺杂于纳米颗粒内的光泄漏情况(图4)。在480 nm光持续辐照条件下，通过光谱仪表征纳米颗粒随光照时间变化的荧光响应。在相同辐照条件下，对比于四氢呋喃溶液中的 FITC发光强度，纳米颗粒中FITC的发光强度下降较少，表明掺杂FITC的纳米传感器有较好的光稳定性。

图4 FITC在THF溶液中和纳米颗粒中的光稳定性
Fig.4 Photobleaching of FITC in THF and NPs

为了研究荧光pH纳米传感器的可逆性，将纳米传感器交替置于pH为3和9的环境中，然后对其发射光谱变化情况进行表征。如图5所示，当缓冲液的pH于3和9之间交替变化时，纳米传感器的荧光强度可以随着pH值的改变而迅速恢复到原有水平。实验结果表明该荧光pH纳米传感器具有良好的可逆性。

图5 纳米传感器荧光强度对pH响应的可逆性
Fig.5 Reversibility of the responsiveness of nanosensor towards pH

3.3 荧光pH纳米传感器的生物相容性

细胞代谢过程受细胞内pH的调控，细胞内pH的检测可为研究单个细胞的生理和病理过程提供重要信息，pH纳米传感器的生物相容性及细胞吞噬效率是影响细胞内pH检测的重要因素。为验证FITC-NPs的生物相容性，我们通过MTT毒性检测方法分析了FITC-NPs对细胞存活率的影响(图6)。首先在96孔板中，将HepG2细胞以每孔8 000个细胞的密度进行接种；培养24 h后，加入不同浓度的 FITC-NPs分散液(5，10，15，20，25 mg/L)；孵育24 h后，每孔加入0.02 mL的MTT溶液；4 h后清除孔内废液，每孔加入0.15 mL DMSO，利用酶标仪测定样品在490 nm波长处的光吸收值，进而来评估细胞的相对成活数量。从图中可以看出，未吞噬纳米颗粒的HepG2细胞的存活率为100%，当纳米颗粒的浓度从5 mg/L逐渐增加至20 mg/L时，均未对细胞活性产生明显抑制作用，实验结果表明荧光pH纳米传感器具有良好的生物相容性。

图6 利用MTT法检测FITC-NPs对HepG2细胞的毒性
Fig.6 Viability of HepG2 cells loaded with FITC-NPs at various concentrations determined by MTT assay

细胞对纳米传感器的吞噬效率是细胞内pH检测的关键，通过共聚焦显微镜成像观察FITCNPs在HepG2细胞中的分布情况。首先将HepG2细胞接种于共聚焦培养皿中孵育过夜，加入含有FITC-NPs(20 mg/L)的培养液培养24 h；然后进行激光共聚焦荧光成像，激发波长选择488 nm，发射光收集波段选择520～580 nm。如图7所示，HepG2细胞中可以检测到FITC-NPs的绿色荧光信号，纳米颗粒主要分布于细胞质中，并未进入细胞核内；纳米颗粒的吞噬过程主要是基于细胞的内吞作用，位于细胞质中的纳米颗粒发光分布不均匀，可能是因为颗粒产生积聚。共聚焦成像结果表明荧光pH纳米传感器具有良好的生物相容性，能够被细胞有效吞噬，有利于细胞内pH的检测应用。

图7 负载FITC-NPs的HepG2细胞的明场成像(a)、共聚焦成像(b)和叠加图(c)。
Fig.7 DIC(a)，confocal fluorescence images(b)and overlay fluorescence image(c)of HepG2 cells loaded with FITC-NPs.

4 结 论

本文利用共沉淀法制备了一种新型的荧光pH纳米传感器。该纳米传感器采用异硫氰酸荧光素作为pH敏感染料分子，异硫氰酸荧光素荧光强度随pH增加而上升，当pH值从3变至9时，荧光强度增大约38倍，pKa值为 6.07，纳米传感器荧光信号具有良好的pH响应灵敏度。该荧光pH纳米传感器具有小粒径、高灵敏度、较好的光稳定性、良好的可逆性和生物相容性。通过激光共聚焦成像表明该传感器具有较高的细胞吞噬效率，在细胞内pH值的实时动态监测方面具有广阔的应用前景。