基于表面增强拉曼光谱的酪氨酸酶可抛式传感器研究

1 引 言

酪氨酸酶(TYR)作为一种重要的氧化还原酶，可将邻苯二酚类物质催化氧化为邻苯二醌类化合物，参与人体内黑色素的合成[1]。研究表明，人体血清中酪氨酸酶活性正常水平约为6.5～9.5 U/mL[2]，酪氨酸酶不足会导致白癜风[3]； 过表达时，则可引起雀斑[4]和帕金森氏综合征[5]，是黑色素瘤的标志物之一[6]。因此检测生物样本中的酪氨酸酶具有重要的临床意义[7]。目前，用于检测酪氨酸酶的方法主要有比色法[8]、电化学法[9]和荧光法[10～13]等，这些方法或操作简便、或灵敏度较高，但在酪氨酸酶活性实际检测中也面临着一些挑战，如特异性不强、受光漂白或光毒性影响等[14～17]。

表面增强拉曼光谱(SERS)能提供分子指纹信息，具有灵敏度高、检测快速等优势[18～20]。SERS技术已被用于蛋白等生物分子的检测分析，但由于蛋白分子较为复杂，SERS谱图的解析较为困难，使其直接检测受到限制[21]。而基于化学反应的SERS传感策略则有望克服此类问题，该策略将具有SERS活性和与待测物反应的性能集于传感器或探针，可产生灵敏清晰的SERS信号，只需要观察传感器或探针与目标检测物反应前后产生的光谱变化即可实现检测[22]。Li等[23]基于叠氮化合物与硫化氢的特异性反应，研制了新型高灵敏特异性SERS纳米传感器，实现了单细胞中硫化氢气体信号分子的原位监测。

丝网印刷技术具有印制过程均匀可控，以及网印产品重现性好、小巧便携、费用低廉等优点[24]。Qu等[25]利用丝网印刷技术批量制备出稳定性好、重现性高，且易于保存携带的可抛式SERS传感器，对罗丹明6G的检测灵敏度可达10-13 mol/L，并且方便大批量样品检测中一次性使用，避免交叉污染。但血清中酪氨酸酶的丝网印刷SERS传感器研究尚未见报道。

本研究结合SERS和丝网印刷传感器的优势，制备了一种用于检测酪氨酸酶的可抛式SERS传感器，优化了检测条件，为血清中酪氨酸酶检测和酪氨酸酶抑制剂筛选提供了灵敏快捷的分析方法。

2 实验部分

2.1 仪器和试剂

USB2000紫外-可见光谱仪(美国Ocean Optics 公司)； Ultra 55扫描电子显微镜(德国Carl Zeiss公司)； JEM-2100高分辨透射电子显微镜(日本JEOL公司)； BWS415便携式激光拉曼光谱仪(美国B&W Tek公司)； AT-259A丝网印刷机(东远精技工业有限公司)。

AgNO3(99%)、柠檬酸三钠(≥99%)、KCl(≥99%)、羧甲基纤维素钠(CMC，Mw=70000，粘度≥1200 mPas)和酪氨酸酶(≥1,000 U/mg)购于Sigma-Aldrich公司； 谷胱甘肽(GSH, 95%)、尿素(99%)和NaCl(≥99.5%)购于阿拉丁试剂有限公司。Gibco 胎牛血清购于Thermo Fisher 公司。NaClO(99.7%)和H2O2(30 %)购于上海凌峰化学试剂有限公司。实验用水为去离子水(18 MΩ cm)。

2.2 实验方法

2.2.1 4-巯基邻苯二酚的合成 在氮气保护下，将0.85 g 3,4-二甲氧基苯基甲硫醇冰浴冷却至-10℃； 加入2.50 g BBr3，反应12 h； 然后分离有机相，干燥，提纯得到4-巯基邻苯二酚[26]。质谱表征显示, 合成物在m/z 142.0090处有一个强峰，与4-巯基邻苯二酚相吻合。

2.2.2 丝网印刷浆料的制备 按照文献[27]方法制备银纳米颗粒，制备好的银胶于4℃保存。制备丝网印刷银浆时，在银纳米颗粒上修饰4-巯基邻苯二酚，6500 r/min离心5 min，移除99%上层清液，与4.0%羧甲基纤维素钠(CMC)按照3∶1(V/V)混合，制得丝网印刷浆料。

2.2.3 酪氨酸酶传感器的制备 依据设计的阵列网板，参考文献[25]中的方法，在纸质基体上利用丝网印刷机分层印刷碳浆和4-巯基邻苯二酚功能化的银纳米颗粒浆料，印制SERS传感器阵列。主要印制过程为：将纸质基体与阵列网板分别固定于丝网印刷机的相应位置并将印刷浆料放置于网板一端，利用刮刀挤压浆料透过阵列图形区域，然后将印制好的传感器阵列从丝网印刷机中取出烘干，保存。

2.2.4 酪氨酸酶的检测 酪氨酸酶用K2HPO4-KH2PO4缓冲液(50 mmol/L, pH=5.6)溶解，分装后，于-20℃避光储存，使用时取出，在37℃融解。将酪氨酸酶溶液(25 kU/mL)梯度稀释，加入到1 mL K2HPO4-KH2PO4缓冲液(10 mmol/L, pH=7.4)中，获得不同浓度的酪氨酸酶溶液。将SERS传感器插入溶液，于37℃孵育5 min，取出传感器，采集拉曼光谱。血清加标回收实验采用相似步骤完成检测。

3 结果与讨论

3.1 检测原理

通过在银纳米颗粒上修饰新合成的4-巯基邻苯二酚，并将其印刷到已印有碳层的纸质基体上，制备可抛型酪氨酸酶SERS传感器。如图1所示，在氧气存在下，酪氨酸酶可将传感器上的4-巯基邻苯二酚的羟基催化氧化为羰基，导致传感器的SERS光谱发生变化，并产生新的SERS谱峰。基于这一特征性SERS光谱信号，可实现对生物样品中酪氨酸酶的检测分析。

图1 表面增强拉曼光谱传感器的制备及其对酪氨酸酶的检测
Fig.1 Schematic illustration of preparation of surface-enhanced Raman scattering (SERS) sensor for detection of tyrosinase (TYR)

3.2 传感器表征

所制备的SERS传感器阵列有10×4个传感点位，每个传感点位约为28 mm2，可裁剪为单个可抛式传感器，独立完成便携检测(图2A)。扫描电镜表征显示(图2B)，传感器上的银纳米颗粒为球形，直径约50 nm，且粒径分布均匀，具有较好的SERS增强活性[28]。进一步考察发现，传感器与酪氨酸酶孵育后，SERS光谱发生明显变化，在484 cm-1处出现新的信号峰(图2C)。通过密度泛函理论计算可知，484 cm-1处谱峰主要来自于振动，而784、898和1071cm-1处谱峰归因于与的振动叠加。如前所述，这是由于酪氨酸酶催化氧化作用所致，表明传感器对酪氨酸酶有优良的SERS响应能力。此外，传感器制备的重现性考察实验表明，随机选取10个传感点位的SERS谱图基本一致(图3A)，并且在1071 cm-1处代表性谱峰强度的相对标准偏差在10%以内(图3B)，重现性良好。

图2 (A)SERS传感器阵列实物图； (B)传感器银纳米颗粒SEM图； (C)传感器与酪氨酸酶孵育前(a)、后(b)的SERS光谱图
Fig.2 (A) Photo of SERS sensor arrays;(B) Scanning electron microscopy (SEM) image of silver nanoparticles on SERS sensor;(C) SERS spectra of sensor in the absence (a) and presence (b) of TYR

图3 (A)随机选取丝网印刷SERS传感器10个传感点位的SERS谱图； (B)10个光谱中1071 cm-1处谱峰强度
Fig.3 (A) SERS spectra collected from 10 randomly selected printed spots from the sensor;(B) Intensity distribution of peak at 1071 cm-1 in the 10 spectra

3.3 检测条件的优化

优化了孵育pH值、温度和时间等酪氨酸酶的检测条件。由图4A和图4B可知，pH值从5.0增长到7.4时，表面增强拉曼光谱中拉曼位移484 cm-1处的峰强度(I484)随之增强，pH值>7.4时，I484减弱； 检测温度在37℃、pH=7.4时，I484最强； 这可能是由于此时酪氨酸酶活性最大[29]，因此更适合传感器检测。由图4C可见，I484随孵育时间延长而增强，时间超过5 min后，I484基本保持不变，表明酪氨酸酶催化反应达到平衡，所以选择酪氨酸酶的检测时间为5 min。即本传感器可以在5 min内完成检测，实现对酪氨酸的快速分析[30～32]。

图4 反应体系pH值(A)、孵育温度(B)和时间(C)对传感器检测TYR(100 U/mL)的影响
Fig.4 Effect of reaction pH value (A), temperature (B) and time (C) on the intensity of peak at 484 cm-1 in the presence of 100 U/mL TYR

3.4 抗干扰性

图5 (A)传感器检测TYR与不同生物分子混合样品的SERS谱图(a～l: TYR, TYR + K+, TYR + Na+, TYR + Mg2+, TYR + Ca2+, TYR + Fe3+, TYR +  TYR + ClO-, TYR + H2O2, TYR + urea, TYR + AchE, TYR + glucose;Fe3+浓度为100 μmol/L，AchE浓度为1 mg/mL，其它干扰物质的浓度为500 μmol/L； TYR浓度为100 U/mL； (B)图A加入酪氨酸酶和各生物相关分子后SERS光谱中484 cm-1处的信号强度(I484)
Fig.5 (A) SERS spectra of SERS sensor in the presence of TYR and different biology relevant species (a-l: TYR, TYR + K+, TYR+Na+, TYR+Mg2+, TYR+Ca2+, TYR+Fe3+,  TYR+ClO-, TYR+H2O2, TYR+urea, TYR+AchE, TYR+glucose);Fe3+ is 100 μmol/L, AchE is 1 mg/mL, others is 500 μmol/L;TYR is 100 U/mL;(B) SERS intensity at 484 cm-1 (I484) based on the spectra in (A)

在待测体系中分别加入酪氨酸酶与各相关干扰成分的混合物，干扰成分包括阳离子(K+、Na+、Mg2+、Ca2+、Fe3+)、阴离子活性氧物质(H2O2)及有机生物分子(Urea, AchE, Glucose)。与待测体系中仅有酪氨酸酶相比，在干扰物质存在时，I484变化91%～103%(图5)，表明所制备的SERS传感器具有优良的抗干扰性能，这得益于酪氨酸酶催化反应的特异性和SERS光谱可提供分子指纹信息的综合优势。传感器出色的抗干扰能力使其适于血清等复杂生物样品的检测分析。

3.5 传感器分析性能

图6A和6B分别为不同浓度酪氨酸酶时，传感器测得的表面增强拉曼光谱及相应的酪氨酸酶检测标准曲线图。随酪氨酸酶浓度的升高，I484逐渐增强； I484与酪氨酸酶浓度在1～100 U/mL范围内呈良好的线性关系，线性回归方程为y=1089.49x + 593.69，检出限为0.28 U/mL(3σ)。与已报道方法比较(表1)，SERS传感器在线性范围和检出限方面具有综合优势，这主要是得益于SERS技术的高灵敏性，有利于生物样品中低浓度酪氨酸酶的灵敏检测。

3.6 血清样品分析

为评估所研制的传感器分析生物样品中酪氨酸酶的可行性，对胎牛血清(FBS)中TYR进行了检测。如表2所示，4个加标水平下，酪氨酸酶的回收率在88.1%～104.6%之间，相对标准偏差(RSD)在0.5%～3.4%之间，良好的检测性能可能是由于酶催化反应的专一性和SERS传感器的高重现性和选择性，表明所研制传感器可用于血清样品中酪氨酸酶的检测。

3.7 TYR抑制剂的筛选和评估

图6 (A)传感器检测不同浓度TYR(a～g：1、2、5、10、20、50、100 U/mL)的SERS谱图； (B)I484与酪氨酸酶浓度对数之间的关系
Fig.6 (A) SERS spectra of various concentrations (a-g: 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100 U/mL) of TYR by the present sensor;(B) Plot of I484 versus logarithm of concentration of TYR

苯甲酸等抑制剂可以抑制酪氨酸酶活性，用于治疗皮肤病[3,33]。利用所研制的SERS传感器考察了苯甲酸对酪氨酸酶活性的影响。图7为传感器对不同浓度苯甲酸与酪氨酸酶在37℃孵育20 min的检测结果。当苯甲酸浓度从0.1 mmol/L上升到20 mmol/L时，I484逐渐降低，当苯甲酸浓度大于20 mmol/L时, I484接近于传感器本底强度。这是由于当体系中苯甲酸浓度升高后，其对酪氨酸酶活性抑制增强，使得酪氨酸酶对传感器上探针分子的催化氧化能力减弱直至消失。I484和苯甲酸浓度在0.2～20 mmol/L范围内近似呈线性关系，根据检测结果可计算出相应的IC50值约为1.82 mmol/L，与文献[34]报道的结果相近。上述结果表明，所研制的可抛式SERS传感器可用于酪氨酸酶抑制剂的筛选和检测。

表1 不同酪氨酸酶检测方法性能比较

Table 1 Comparison of different methods for detection of TYR

表2 胎牛血清中TYR回收率检测

Table 2 Recovery of TYR in fetal bovine serum(FBS)(n=3)

图7 (A)传感器对不同浓度苯甲酸(a～i： 0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、30 mmol/L)抑制活性酪氨酸酶(10 U/mL)响应的SERS谱图； (B)I484与苯甲酸浓度对数之间的关系
Fig.7 (A) SERS spectra of TYR (10 U/mL) in the presence of different concentrations (a-i: 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20, 30 mmol/L) of benzoic acid;(B) Plots of I484 versus logarithm of concentration of benzoic acid

4 结 论

合成了4-巯基邻苯二酚功能化银纳米颗粒浆料，采用丝网印刷技术制备了可抛式SERS传感器，用于检测TYR。此传感器重现性高，SERS信号相对标准偏差小于10%； 在优化条件下，5 min内即可完成TYR的快速检测； 传感器制备和检测方法简单，抗干扰能力强，对TYR的检出限低于0.3 U/mL，血清样品中加标回收率为88.1%～104.6%。此传感器在酪氨酸酶活性分析及其抑制剂筛选检测相关生物医学领域中具有良好的应用潜力。